[發明專利]一種海水池塘沉積物微生物群落結構的分析方法

在審

• 申請號: 201410050852.1
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103789437A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王琦;李健;陳萍;高天翔;張秀梅
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學;中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

1.一種海水池塘沉積物微生物群落結構的分析方法，包括如下步驟：

1）從池塘沉積物樣品中提取基因組DNA；提取的DNA稀釋后于-20℃保存備用；

2）建立擴增細菌16SrDNA?V3區的PCR反應體系和反應程序，

3）將步驟2）的擴增產物與上樣液混合進行變性梯度凝膠電泳，電泳結束后進行銀染檢測；

4）利用Quantity?One軟件對圖譜進行分析；

5）回收銀染獲得的條帶，

6）對回收條帶的PCR產物進行T-克隆測序，將測序結果與GenBank比對得到海水池塘沉積物微生物群落結構。

2.如權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟1）是用CTAB法提取的池塘沉積物樣品基因組DNA。

3.如權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2）中擴增所用的引物的序列為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2。

4.如權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2）中反應體系組成為如下：總體積50μl，包括DNA模板100ng，10×buffer5μl，dNTPs4μl，rTaq?DNA聚合酶0.5μl，加ddH₂O至50μl。

5.如權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2）中PCR反應程序為降落PCR,95℃預變性5min,前10個循環94℃變性30s，58℃退火30s；每個循環降低0.5℃；72℃延伸30s；后25個循環94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30sec；最后72℃延伸10min。

6.如權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟3）中進行變性梯度凝膠電泳的條件如下：丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度是45%-55%，電壓60v，60℃電泳10h。