[發(fā)明專利]枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因改善煙草糖水平的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410050727.0
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN103789346A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦巧平;張嵐嵐;賴齊賢
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;C12N15/56;C12N15/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

1.一種枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶及其編碼基因改善煙草糖水平的方法，其特征是按如下步驟進行：

(1)分離克隆枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶基因的cDNA片段序列：提取枇杷葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過與GenBank已知的植物液泡轉(zhuǎn)化酶序列進行比對設(shè)計簡并引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中并測序，利用分子生物學(xué)工具分析測序結(jié)果，與其他植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因比對，確定為枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶基因的保守區(qū)片段；

(2)分離克隆枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶基因的cDNA全長序列：根據(jù)上述枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶基因cDNA片段序列設(shè)計引物，通過cDNA末端快速擴增技術(shù)獲得基因的全長cDNA序列，與其他植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因比對，通過分析基因編碼區(qū)及液泡轉(zhuǎn)化酶特有的功能域確定分離到枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶全長cDNA序列，并命名為EJVIN，EJVIN基因編碼區(qū)核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No：1所示，編碼羹基酸序氨如序列表中SEQ?ID?No：2所示；

(3)枇杷液泡轉(zhuǎn)化酶基因雙元表達載體的構(gòu)建：根據(jù)上述基因EJVIN的完整編碼區(qū)設(shè)計引物，進行PCR擴增，利用無縫克隆技術(shù)將擴增產(chǎn)物與經(jīng)過酶切的植物表達載體pCAMBIA-1302進行連接，將EJVIN正向插入pCAMBIA-1302，獲得植物過量表達重組雙元表述載體，命名為pCAMBIA-1302-EJVIN；

(4)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化：將上述表達載體pCAMBIA-1302-EJVIN利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得具有特異抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因植株，提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，利用特異引物進行PCR擴增鑒定，確定成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，單株收種子，對其后代進行觀察鑒定；

(5)轉(zhuǎn)基因煙草生長速度和糖分組成水平的試驗與測定：將轉(zhuǎn)基因煙草種子進行播種，轉(zhuǎn)基因煙草與未轉(zhuǎn)基因煙草進行生長速度的對比試驗，生長速度明顯加快；定期采集葉片進行糖含量的高效液相色譜分析，轉(zhuǎn)基因煙草葉片的蔗糖水平顯著降低，而果糖水平顯著提高，說明EJVIN基因既加快煙草生長速度，又能提高葉片的果糖水平，煙草品質(zhì)明顯改善。