[發(fā)明專(zhuān)利]質(zhì)譜法鑒別肉制品中動(dòng)物源性成份

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410050178.7
• 申請(qǐng)日: 2014-02-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103805703A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬慶偉;張海燕;鐘逾;黎大洪;向華;林燕;劉杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 向華
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于鑒定肉制品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法及產(chǎn)品，具體而言是利用PCR技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)豬、牛、羊、雞、鴨、兔源性成分進(jìn)行檢測(cè)的方法及相應(yīng)的試劑盒。

背景技術(shù)

肉制品是人類(lèi)飲食中的重要食品，其含有優(yōu)質(zhì)蛋白和多種必須氨基酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，增加了對(duì)肉類(lèi)食品的需求，市場(chǎng)上出現(xiàn)了很多以次充好、假冒牛肉和羊肉的現(xiàn)象，例如，常見(jiàn)的使用雞鴨豬肉充當(dāng)羊肉，選用豬兔肉冒充牛肉，這嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的財(cái)務(wù)和健康狀況。

另外，由于瘋牛病、豬牛口蹄疫、禽流感等疾病的發(fā)病與流行，導(dǎo)致在特定時(shí)期內(nèi)豬牛羊肉以及雞鴨肉滯銷(xiāo)。在該特定時(shí)期內(nèi)，如果食品監(jiān)管不力，容易發(fā)生不法商販將滯銷(xiāo)肉充當(dāng)其它肉制品的事件。因此，需要嚴(yán)格限制食品中的動(dòng)物源性成分。

此外，我國(guó)是一個(gè)多民族組成的國(guó)家，宗教習(xí)慣使人們的飲食有一定差異，對(duì)肉制品的選擇具有一定的傾向性。例如：回族不吃豬肉。如果清真食品中摻有豬肉，會(huì)影響回族消費(fèi)者的宗教信仰。同時(shí)，一些患病人群如高血壓、脂肪肝等患者對(duì)肉類(lèi)的選擇具有一定特殊性。因此，食品中動(dòng)物源性成分的鑒別已成為人們特別關(guān)注的問(wèn)題。對(duì)肉制品中生物種屬的鑒定在打擊食品摻假偽造、審核食品標(biāo)簽、保障消費(fèi)者知情權(quán)等方面有重要作用。

為了保護(hù)消費(fèi)者的利益和進(jìn)出口貿(mào)易的公平，對(duì)肉制品進(jìn)行檢測(cè)也具有一定的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。傳統(tǒng)的肉制品檢測(cè)采用形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)方法，僅對(duì)生鮮肉具有一定的鑒別作用。但對(duì)經(jīng)過(guò)加工處理的熟肉制品，由于其感官性狀、蛋白質(zhì)成分和其它免疫源性物質(zhì)被破壞，使得傳統(tǒng)的方法很難進(jìn)行準(zhǔn)確的肉類(lèi)品種鑒定，給肉制品的交易和進(jìn)口帶來(lái)了極大的不便。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200710175520.6、“雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重PCR快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用”，該方法能夠快速鑒別動(dòng)物源性成分，但難以對(duì)肉制品中微量成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，且需要進(jìn)行電泳凝膠判斷結(jié)果，導(dǎo)致不夠經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2012101870313、“特定肉制品的LAMP法檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法”公開(kāi)了一種特定肉制品的LAMP法檢測(cè)試劑盒，其包括五組相互獨(dú)立的A1-A5型反應(yīng)液，該五組反應(yīng)液可分別檢測(cè)牦牛肉、雞肉、豬肉、兔肉和羊肉。然而，該方法需要對(duì)每組反應(yīng)液設(shè)置2個(gè)梯度的擴(kuò)增引物體系，同時(shí)每組涉及一組外引物和內(nèi)引物以及一組環(huán)引物對(duì)，共計(jì)6種引物，且沒(méi)有各組體系之間沒(méi)有通用引物，因此導(dǎo)致整個(gè)過(guò)程設(shè)計(jì)繁瑣、且引物之間相互干擾，從而從一定程度上影響了檢測(cè)準(zhǔn)確性。另外，該申請(qǐng)的實(shí)施例中只能同時(shí)檢測(cè)兩種肉制品，并不能同時(shí)檢測(cè)兩種以上的肉源。

中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200810243974.7、“一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)鑒別肉制品中源性成分的方法”，涉及PCR法，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及有無(wú)鑒定肉制品中動(dòng)物源性成分。該方法過(guò)程需要進(jìn)行大量的凝膠電泳，分析其凝膠圖譜，整個(gè)過(guò)程較為繁瑣，仍然停留在傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明原理在于：提供了一種聯(lián)合PCR技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，鑒定肉制品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方案。其中：使用一對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；在單堿基延伸過(guò)程中，對(duì)PCR的純化產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸，延伸引物延伸一個(gè)核苷酸；單堿基延伸產(chǎn)生由延伸引物和延伸產(chǎn)物組成的待檢混合物，以質(zhì)譜對(duì)待檢混合物進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)質(zhì)譜峰確定待檢混合物中各物質(zhì)分子量，并與預(yù)先計(jì)算的各延伸引物和延伸產(chǎn)物的理論分子量進(jìn)行比對(duì)，從而確定待檢混合物是否包含特定的物質(zhì)。

因此，本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種鑒定肉制品中動(dòng)物源性成分的引物系統(tǒng)或引物組，其序列如表1所示。

其中，各位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的延伸引物及延伸產(chǎn)物分子量如表2所示。

在一個(gè)實(shí)施方案中，上述PCR擴(kuò)增引物序列為核心序列，其在5'端可包括保護(hù)堿基序列，優(yōu)選5-15個(gè)堿基。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，保護(hù)堿基序列選自在5'段加入10bp的tag（ACGTTGGATG），例如，PCR引物SEQ?ID?NO:1在5'段加入10bp的tag（ACGTTGGATG）后即為SEQ?ID?NO:9：5'-ACGTTGGATGCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3’。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作為接頭的堿基序列。

CAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT

本發(fā)明第二個(gè)目的是提供了由上述引物系統(tǒng)所制備的用于鑒定肉制品中動(dòng)物源性成分的產(chǎn)品。