[發明專利]雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體及其應用

有效

• 申請號: 201410049351.1
• 申請日: 2014-02-12
• 公開（公告）號: CN103993033B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 言燕華;王廣東;張昌偉;韋武青;馬志虎
• 申請（專利權）人: 鎮江市蔬菜研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 鎮江京科專利商標代理有限公司32107
• 代理人: 夏哲華

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，本發明涉及一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒的RNAi載體，以及其在介導對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環斑病毒（ORSV）的抗性中的應用。

背景技術

蝴蝶蘭（Phalaenopsis?ssp.）為蘭科蝴蝶蘭屬花卉，于1750年最早被發現，迄今已發現七十多個原生種，在中國臺灣和泰國、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等地均有分布。蝴蝶蘭因其花形優美，顏色華麗，為熱帶蘭中的珍品，有“蘭中皇后”之美譽，再加上耐貯運、宜于室內擺放、經濟效益高等優點成為花卉業的新寵，蝴蝶蘭盆花已成為全球重要的農業產業。近幾年我國蝴蝶蘭生產發展迅速，1997年大陸蝴蝶蘭生產企業屈指可數，年上市量僅有20萬株左右，而到2003年蝴蝶蘭上市量超過1，000萬株，產值達5億元，2010年，我國蝴蝶蘭年宵花上市量已達到2，610萬株。

隨著我國蝴蝶蘭的大規模種植，病害也日趨嚴重。蝴蝶蘭病毒病是蝴蝶蘭上的一類重要病害，由于蝴蝶蘭大多在生產上依靠組織培養進行無性繁殖，病毒在營養器官中不斷積累，同時病毒還會通過組織培養和溫室內植株管理造成的傷口進行傳播，使蝴蝶蘭病毒防治困難，嚴重影響蝴蝶蘭的生長和觀賞品質，并且歐美等國家對蝴蝶蘭病毒檢疫非常嚴格，帶有病毒病的出口蝴蝶蘭種苗和成品給我國出口企業造成巨大損失。目前生產上還沒有有效的藥物進行防治蝴蝶蘭病毒病，只能通過淘汰病株和莖尖培養脫毒進行防治，但莖尖脫毒技術操作難度大，耗費大量的人力物力，脫毒效果有時并不理想，并且在擴繁和栽培過程中還會感染病毒，因此利用基因工程等技術選育蝴蝶蘭抗病品種成為生產上的迫切需要。

目前，世界上已報導的蘭花病毒有：建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒、建蘭輕性花葉病毒、建蘭環斑病毒、番茄環斑病毒、萬代蘭花葉病毒、石斛蘭花葉病毒、洋蘭斑點病毒和黃瓜花葉病毒等10來種病毒，其中以建蘭花葉病毒(Cymbidium?mosaic?virus,CymMV)和齒蘭環斑病毒（Odontoglossum?ringspot?virus,ORSV）發生最為普遍。建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒是侵染蝴蝶蘭的兩種主要病毒病原。

CymMV隸屬線形病毒科、馬鈴薯X病毒屬，線狀粒子長475nm～490nm、直徑13nm。ORSV隸屬煙草花葉病毒屬，桿狀粒子長300nm、直徑18nm。兩種病毒可單獨侵染或復合侵染蘭科植物，引起花葉、壞死、葉脈褪綠、條斑等癥狀，復合侵染時可導致植株矮化，葉片畸形等重癥，造成蝴蝶蘭、石槲蘭、大花惠蘭、文心蘭等多種熱帶蘭及國蘭產生嚴重病害，大大降低蘭花的商品價值。我國報導蘭花病毒始于1983年朱本明等從上海的蘭花上分離到兩種病毒，鑒定為建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒。沈淑琳（1990）對這兩種病毒的生物、生化特性進一步系統研究，證實是我國蘭花上最主要的病毒。

蝴蝶蘭病毒主要通過介體或汁液傳播。介體是重要的傳播途徑，可通過蚜蟲、線蟲、螨類等進行傳播。汁液傳播是通過葉片的相互摩擦，或人的組織培養和田間作業，使健康葉片造成微傷，導致病毒傳播。通過上述兩種途徑使蝴蝶蘭感染病毒，并通過組培擴繁傳至下一無性世代，從而在蝴蝶蘭營養體中長期積累，導致產量和品質下降。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是最近幾年發展起來的一門新興的在轉錄水平上的基因阻斷技術。是一種雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上關閉相應序列基因的表達或使其沉默的過程，也就是序列特異性的轉錄后基因沉默(post-transcriptional?gene?silencing，PTGS)。不同的有機體，包括植物、果蠅、線蟲及一些哺乳動物大多能利用RNA干擾機制來抵御病毒及其他外來核酸的侵人。提示它可能是生物體的一種進化保守機制。同時也可能成為特異性沉默內源基因和基因功能分析的一個革命性工具。