[發明專利]用于齦溝液內炎癥標志物檢測的液相芯片試劑盒

在審

• 申請號: 201410049211.4
• 申請日: 2014-02-12
• 公開（公告）號: CN103823054A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 李茵;張振庭
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京口腔醫院
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/531
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.用于齦溝液內炎癥標志物檢測的液相芯片試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括：(1)3-plex包被微球：含有分別包被了IL-1β捕獲抗體、IL-6捕獲抗體和Osteocalcin捕獲抗體的不同顏色編碼微球；

(2)3-plex生物素標記檢測抗體：分別用生物素標記的IL-1β、IL-6和Osteocalcin的檢測抗體；以及

(3)鏈親和素藻紅蛋白。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的捕獲抗體分別為：IL-1β捕獲抗體，克隆號為P2H3；IL-6捕獲抗體，克隆號為B-E8；Osteocalcin捕獲抗體，克隆號為1-22。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測抗體分別為：IL-1β檢測多克隆抗體，克隆號為EP408Y；IL-6檢測多克隆抗體，克隆號為E457；Osteocalcin檢測多克隆抗體，克隆號為aa?59-74。

4.制備權利要求1-3任一項所述試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）相應捕獲抗體包被相應微球

a.取羧基微球用漩渦振蕩器振蕩微球懸液20s，使微球混合均勻；

b.取羧基微球1×10⁶個，轉移到離心管中，≥8000g離心2min，沉淀微球；

c.移走上清，加入dH₂O?100μl，用漩渦振蕩器振蕩20s重懸微球，≥8000g離心2min，沉淀羧基微球；移走上清，加入100mmol/L，pH值6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液80μl，用漩渦振蕩器振蕩20s，重懸洗滌的羧基微球；

d.加入50mg/ml的N羥基硫代琥珀酰亞胺10μl，用漩渦振蕩器輕輕地振蕩；

e.加入50mg/ml的1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺10μl，用漩渦振蕩器輕輕振蕩；

f.室溫孵育20min，每隔10min用漩渦振蕩器輕振，≥8000g離心2min，沉淀活化的羧基微球；

g.移走上清，加入50mmol/L，pH值5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸，漩渦振蕩器振蕩20s，重懸活化的羧基微球，≥8000g離心2min，沉淀洗滌后的羧基微球；重復該步驟2次，用50mmol/L，pH值5.0的MES洗滌2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩渦振蕩器振蕩20s，在混勻的微球中分別加入50μg?IL-1β、IL-6和Osteocalcin捕獲抗體，用50mmol/L，pH值5.0的MES定容至500μl，用漩渦振蕩器混勻；于室溫置于搖床上孵育2h，≥8000g離心2min，沉淀偶聯好的微球；

h.移走上清，加入PBS-TBN?300μl，漩渦振蕩器振蕩30s；于室溫置于搖床上孵育30min，≥8000g離心2min，沉淀偶聯好的微球；

i.移走上清，加入PBS-TBN?1ml，漩渦振蕩器振蕩30s，≥8000g離心2min，沉淀偶聯好的微球；重復該步驟l次，用PBS-TBN洗滌2次；

j.加入PBS-TBN?1ml，重懸偶聯好且經過洗滌的微球，即得IL-1β、IL-6和Osteocalcin捕獲抗體分別與微球的偶聯體；

k.用細胞計數器計數微球的數量，濃度為2.5×10⁵個/ml；將偶聯好的微球置于4℃避光保存；

（2）IL-1β、IL-6和Osteocalcin檢測抗體的生物素化

l.將1mg的IL-1β、IL-6和Osteocalcin檢測抗體分別用0.1mol/L，pH值8.0的碳酸氫鈉緩沖液稀釋到1mg/ml，終體積為1ml；

m.交互用0.1mol/L，pH值8.0的碳酸氫鈉緩沖液對蛋白質充分透析；

n.用1ml二甲基亞砜溶解N-羥琥珀酰亞氨活化生物素1mg；

o.向1ml的IL-1β、IL-6和Osteocalcin檢測抗體溶液中分別加入1g/L的NHSB溶液120μl；在室溫下持續攪拌，保溫2-4h；

p.加入1mol/L?NH₄Cl溶液9.6μl，在室溫下攪拌10min，在4℃下對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上1ml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1ml/管，蛋白質在1-3ml之間洗脫；樣品加入終濃度為0.5g/L的疊氮鈉及1.0g/L?BSA；將結合產物置于4℃避光保存。