[發明專利]一種甘膽酸免疫檢測試劑及其制備和檢測方法

有效

• 申請號: 201410047767.X
• 申請日: 2014-02-11
• 公開（公告）號: CN103760348A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 虞留明;李冬;陸麗華;張曼;胡瑜
• 申請（專利權）人: 蘇州博源醫療科技有限公司
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576;G01N33/531
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

1.一種甘膽酸免疫檢測試劑，其特征在于，包括：抗甘膽酸特異性抗體、用于檢測抗甘膽酸特異性抗體-甘膽酸復合物的指示試劑；

上述抗甘膽酸特異性抗體由甘膽酸免疫原免疫動物得到，甘膽酸免疫原的結構式如式（I）所示：

式(I)

式中，R為連接基團-(CH₂)_n-O-CH₂-COO-，n為1至20之間的任意整數，載體為具有免疫原性的蛋白質，載體為血清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白；上述指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑或化學發光試劑。

2.根據權利要求1所述的甘膽酸免疫檢測試劑，其特征在于，R為-(CH₂)₂-O-CH₂-COO-。

3.根據權利要求1所述的甘膽酸免疫檢測試劑，其特征在于，上述指示試劑選自酶試劑，包括：酶標偶聯物和酶的底物；上述酶標偶聯物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物；上述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。

4.根據權利要求3所述的甘膽酸免疫檢測試劑，其特征在于，上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與甘膽酸衍生物偶聯形成，上述甘膽酸衍生物的結構式如式（II）所示：

式(II)

上述R為-(CH₂)_n-O-CH₂-COO-，n為1至20之間的整數。

5.根據權利要求4所述的甘膽酸免疫檢測試劑，其特征在于，上述R為-(CH₂)₂-O-CH₂-COO-。

6.一種甘膽酸免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）權利要求4所述的甘膽酸衍生物的合成與純化，并進行結構鑒定；

（2）甘膽酸免疫原的合成：使甘膽酸衍生物的-(CH₂)_n-O-CH₂-COO-基團與具有免疫原性的蛋白質載體連接，n為1至20之間的整數；

（3）用甘膽酸免疫原免疫動物，制備并純化抗甘膽酸特異性抗體；

（4）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物的制備：制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液，激活甘膽酸衍生物，使G6PDH與甘膽酸衍生物連接，純化連接產物；

（5）甘膽酸均相酶免疫檢測試劑的制備：

試劑A的制備：由抗甘膽酸特異性抗體和均相酶底物混合而成；

試劑B的制備：由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物與Tris緩沖液混合而成。

7.根據權利要求6所述的一種甘膽酸免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的步驟（2）中，蛋白質載體為BSA，n=2，具體合成步驟如下：

1）將20mg?BSA溶解于5ml0.2M、pH8.5的PBS中，上述溶液置于燒杯A中；

2）將如下化學品加入到燒杯B中攪拌溶解：20mg甘膽酸衍生物、0.35ml二甲基酰胺DMF、0.35ml乙醇、0.7ml10mM?pH5.0的磷酸鉀緩沖液、40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、5mg?N-羥基硫代琥珀酰亞胺，于室溫下攪拌溶解，反應30分鐘；

3）將燒杯B中的溶液滴加至燒杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下攪拌過夜；將上述攪拌后的混合溶液經過中性磷酸鹽緩沖液透析純化，得到BSA-甘膽酸免疫原，儲存于-20℃。