[發明專利]一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其制備和檢測方法

有效

• 申請號: 201410047754.2
• 申請日: 2014-02-11
• 公開（公告）號: CN103760366A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 虞留明;成志鵬;王英;張曼;顧國浩
• 申請（專利權）人: 蘇州博源醫療科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

1.一種1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，包括：抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體、用于檢測抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體-1,5-脫水山梨醇復合物的指示試劑；所述抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體由1,5-脫水山梨醇免疫原免疫動物得到，所述1,5-脫水山梨醇免疫原的結構式如式（I）所示：

式中，R為連接基團-(CH₂)_n-COO-，n為1至20之間的整數，載體為具有免疫原性的蛋白質或多肽；所述指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑或化學發光試劑。

2.根據權利要求1所述的1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，所述的R為-(CH₂)₄-COO-；所述的載體為血清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白。

3.根據權利要求1所述的1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，所述指示試劑選自酶試劑，包括：酶標偶聯物和酶的底物；所述酶標偶聯物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物；所述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。

4.根據權利要求3所述的1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與1,5-脫水山梨醇衍生物偶聯形成，所述1,5-脫水山梨醇衍生物的結構式如式（II）所示：

R為-(CH₂)_n-COO-，n為1至20之間的整數。

5.根據權利要求4所述的1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，R為-(CH₂)₄-COO-。

6.一種1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）權利要求4所述的1,5-脫水山梨醇衍生物的合成與純化，并進行結構鑒定；

（2）1,5-脫水山梨醇免疫原的合成：使1,5-脫水山梨醇衍生物的-(CH₂)_n-COO-基團與具有免疫原性的蛋白質載體連接，n為1至20之間的整數；

（3）用1,5-脫水山梨醇免疫原免疫動物，制備并純化抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體；

（4）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物的制備：制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液，激活1,5-脫水山梨醇衍生物，使G6PDH與1,5-脫水山梨醇衍生物連接，純化連接產物；

（5）1,5-脫水山梨醇均相酶免疫檢測試劑的制備：

試劑A的制備：由抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體和均相酶底物混合而成；

試劑B的制備：由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯物與Tris緩沖液混合而成。

7.根據權利要求6所述的一種1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的步驟（2）中，蛋白質載體為BSA，n=4，具體合成步驟如下：

1）將20mg?BSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸緩沖液PBS中，上述溶液置于燒杯A中；

2）將如下化學品加入到燒杯B中攪拌溶解：20mg1,5-脫水山梨醇衍生物，0.35ml二甲基酰胺，0.35ml乙醇，0.7ml10mM?pH5.0的磷酸鉀緩沖液，40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺，5mg?N-羥基硫代琥珀酰亞胺，于室溫下攪拌溶解，反應30分鐘；

3)將燒杯B中的溶液滴加至燒杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下攪拌過夜；將上述攪拌后的混合溶液經過中性磷酸鹽緩沖液透析純化，得到BSA-1,5-脫水山梨醇免疫原，儲存于-20℃。