[發明專利]克雷伯氏肺炎桿菌生產2R,3R-丁二醇的方法

有效

• 申請號: 201410046736.2
• 申請日: 2014-02-10
• 公開（公告）號: CN103740771A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 郝健;魏東;史吉平;姜標;陳川
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海高等研究院
• 主分類號: C12P7/18
• 分類號: C12P7/18;C12R1/01
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所 31251
• 代理人: 王法男

技術領域

本發明涉及一種生產2R,3R-丁二醇的方法，特別涉及到一種克雷伯氏肺炎桿菌生產2R,3R-丁二醇的方法。

背景技術

克雷伯氏肺炎桿菌是一種重要的工業微生物，用于生產1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻和2-酮基-D-葡萄糖酸等工業產品。

2,3-丁二醇是一種大宗化學品，其可用于合成塑料和橡膠等行業，同時也被認為是一種潛在的生物燃料，2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇由于凝固點較低，可用于防凍劑（Celinska?E,Grajek?W,Biotechnological?production?of?2,3-butanediol-Current?state?and?prospects.Biotechnol?Adv,2009,27,715-725）。2,3-丁二醇有兩個手性碳，形成內消旋-2,3-丁二醇，2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇三種立體異構體。2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇是對映異構體，結晶點和沸點等性質相同。

有多種微生物可以合成2,3-丁二醇，其中多粘芽孢桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、克雷伯氏產酸桿菌和粘質沙雷氏菌具有較高的2,3-丁二醇生產性能，是具有工業應用前景的菌株。目前報道芽孢桿菌主要生成2R,3R丁二醇，伴隨少量內消旋-2,3-丁二醇；而克雷伯氏菌屬細菌主要生成內消旋-2,3-丁二醇并伴隨少量2S,3S-丁二醇（Ui?S,Masuda?T,Masuda?H,Muraki?H,Mechanism?for?the?formation?of2,3-butanediol?stereoisomers?in?Bacillus?polymyxa.J?Ferment?Technol,1986,64,481-486）。

在克雷伯氏菌屬中，2,3-丁二醇合成途徑始于丙酮酸，兩分子丙酮酸脫羧形成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸在脫羧酶的催化下脫羧形成R-乙偶姻（3-羥基-2-丁酮），乙偶姻在丁二醇還原酶的催化下消耗NADH形成內消旋-2,3-丁二醇。乙酰乳酸可以通過非酶催化形成雙乙酰，雙乙酰在丁二醇脫氫酶的催化下還原形成S-乙偶姻，S-乙偶姻進一步在丁二醇脫氫酶的催化下還原形成2S,3S-丁二醇（Xiao?Z,Xu?P,Acetoin?metabolism?in?bacteria.Crit?Rev?microbial,2007,33,127-140）。

微生物生產的2,3-丁二醇是兩種異構體的混合物，目前有相關報道利用基因工程菌株來生產單一立體構型的2,3-丁二醇。

在克雷伯氏菌屬中，丁二醇脫氫酶由budC基因編碼，該酶具有將乙偶姻還原成丁二醇的能力，也具有將雙乙酰還原成S-乙偶姻的能力，其對底物的酮基還原后形成S構型羥基；因此該酶還原R-乙偶姻形成內消旋-2,3-丁二醇，還原S-乙偶姻形成2S,3S-丁二醇。通過在大腸桿菌中表達來源于克雷伯氏肺炎桿菌的丁二醇脫氫酶基因，同時表達解糖短桿菌的丁二醇脫氫酶，獲得的工程菌株可以利用雙乙酰生產2S,3S-丁二醇（Ui?S.et?al.,Production?of?l‐2,3‐butanediol?by?a?new?pathway?constructed?in?Escherichia?coli?Lett.Appl.Microbiol.,2004,39,533–537）。

通過在大腸桿菌中表達枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脫羧酶基因，再表達枯草桿菌等來源的丁二醇脫氫酶基因，獲得的基因工程菌株可以利用葡萄糖為碳源合成2R,3R-丁二醇（Yan?Y,Lee?C,Liao?J,Enantioselective?synthesis?of?pure(R,R)-2,3-butanediol?in?Escherichia?coli?with?stereospecific?secondary?alcohol?dehydrogenases.2009,Org?Biomol?Chem7,3914）。

目前并無利用克雷伯氏肺炎桿菌發酵生產2R,3R-丁二醇的報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種生產2R,3R-丁二醇的方法。通過該方法，能利用甘油為碳源發酵生產高光學純度的2R,3R-丁二醇。

為解決上述技術問題，本發明中利用克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiella?pneumoniae）生產2R,3R-丁二醇的方法，是在氧限制條件下，通過丁二醇脫氫酶酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎桿菌，以甘油為碳源，發酵生產2R,3R-丁二醇。