[發(fā)明專利]擴(kuò)增植物組織中內(nèi)生真菌ITS基因的方法及所用引物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410045774.6
• 申請(qǐng)日: 2014-02-08
• 公開（公告）號(hào): CN103834728A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁志林;章初龍;陳益存
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高效擴(kuò)增植物組織中內(nèi)生真菌ITS基因的技術(shù)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

植物內(nèi)生真菌（Endophytic?fungi）是一種特殊的真菌共生體，可定植在根、莖、葉、花、種子等各種組織器官，但并不引起宿主明顯的病癥。大量研究已經(jīng)證實(shí)植物組織中蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生真菌類群，是全球真菌多樣性的重要組成部分。有專家預(yù)測(cè)，全球植物內(nèi)生真菌物種數(shù)量至少有100-130萬(wàn)（Dreyfuss?and?Chapela,1994;Ganley?et?al.,2004）。內(nèi)生真菌同樣具有高度的功能多樣性，在維持植物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、促進(jìn)凋落物分解、協(xié)同植物生長(zhǎng)和抗逆等方面發(fā)揮了不可忽視的作用。同時(shí)，內(nèi)生真菌還是活性產(chǎn)物的天然資源寶庫(kù)。

微生物生態(tài)學(xué)的重要命題之一是研究特定樣品中微生物類群的物種多樣性及其環(huán)境響應(yīng)機(jī)制。微生物分離、培養(yǎng)和鑒定是研究微生物多樣性的傳統(tǒng)方法，也一直沿用至今。然而，可培養(yǎng)微生物占總微生物的比例可能還不足1%，因此很難反應(yīng)環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的全貌。隨著分子生物學(xué)和DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，利用高靈敏的分子手段檢測(cè)微生物多樣性（環(huán)境PCR方法）已經(jīng)成為微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)強(qiáng)有力的工具。如PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳）、Clone?library（克隆庫(kù)構(gòu)建）和高通量測(cè)序（pyrosequencing，如羅氏454GS?FLX和Illumina?MiSeq平臺(tái)等）等技術(shù)方法正逐步應(yīng)用于森林和農(nóng)田土壤、深海底泥、人體和動(dòng)物的腸道、糞便和水體等環(huán)境樣品進(jìn)行微生物多樣性分析。

植物各種組織器官也是微生物生長(zhǎng)繁衍的理想棲息地，然而目前對(duì)植物內(nèi)生菌生物多樣性的廣度和深度的認(rèn)識(shí)仍十分有限。主要原因在于上述的分子檢測(cè)手段都依賴于對(duì)特定研究樣品總基因組DNA的提取，制備的DNA樣品中含有大量的植物來(lái)源的DNA。而在土壤、底泥和腸道排泄物等樣品的總基因DNA中，非微生物源基因組占較少的比例。即，當(dāng)提取植物組織總基因組DNA時(shí)，其中含有的內(nèi)生真菌DNA只占極少的比例，而在土壤、底泥和腸道排泄物等樣品的總基因DNA樣品中,真菌和其他微生物DNA占的比例就相對(duì)高。因此在使用真菌通用引物從總基因組DNA中擴(kuò)增真菌源基因產(chǎn)物（通常是用于系統(tǒng)發(fā)育分析的保守基因SSU/LSU/ITS等）的成功率很低，反而能擴(kuò)增出植物（宿主）源的基因片段，即產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增。這將顯著影響后期基因序列的質(zhì)量和分析結(jié)果。目前公認(rèn)真菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal?Transcribed?Spacer，ITS）能有效在種的水平上區(qū)分真菌類群，因此是研究真菌多樣性的理想條形碼。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能擴(kuò)增植物組織中內(nèi)生真菌ITS基因的方法及所用引物；本發(fā)明屬于一種利用兩組特異性引物高效擴(kuò)增植物組織中真菌ITS兩個(gè)片段的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種能擴(kuò)增植物組織中內(nèi)生真菌ITS基因的引物，

所述引物包括巢式PCR第一輪擴(kuò)增引物對(duì)和巢式PCR第二輪擴(kuò)增引物對(duì)；

所述巢式PCR第一輪擴(kuò)增引物對(duì)為：

正向引物NSA3：5′-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3′，

反向引物NLC2：5′-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3′；

所述巢式PCR第二輪擴(kuò)增引物對(duì)為以下任一引物對(duì)：

①、

正向引物ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，

反向引物ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；

②、

正向引物ITS1-F_KYO2：5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′，

反向引物ITS2_KYO2：5′-TTYRCTRCGTTCTTCATC-3′；

③、

正向引物fITS7：5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′，

反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；

④、

正向引物ITS3_KYO2：5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′，

反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述引物進(jìn)行的擴(kuò)增植物組織中內(nèi)生真菌ITS基因的方法，包括植物組織基因組的提取，將提取所得的模板DNA依次進(jìn)行以下步驟：

PCR擴(kuò)增：