[發明專利]從D-氨基酸制備L-氨基酸的方法

在審

• 申請號: 201410044828.7
• 申請日: 2005-01-27
• 公開（公告）號: CN103834607A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 維爾納·胡梅爾;比吉特·戈伊克;斯特芬·奧斯瓦爾德;克里斯托夫·韋克貝克;克勞斯·胡特馬赫爾
• 申請（專利權）人: 贏創德固賽有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/08;C12P13/10;C12P13/22;C12P13/06;C12P13/24;C12P13/14;C12P35/06;C12R1/19;C12R1/07
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

本申請是2005年1月27日提交的題為“從D-氨基酸制備L-氨基酸的方法”的中國專利申請200580005253.7的分案申請。

本發明涉及重組微生物，其與起始微生物相比具有更高濃度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脫氫酶、NADH共底物再生酶、并且如果需要還具有過氧化氫酶，本發明還涉及通過使用這些微生物從D-氨基酸制備L-氨基酸的方法。

目前許多天然氨基酸是通過用遺傳優化的細菌進行發酵而以對映異構體純的形式而制備(de?Graaf?AA,Eggeling?L,Sahm?H2001.Metabolic?Engineering?for?L-Lysine?Production?by?Corynebacterium?glutamicum.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73:9-29；Sahm?H,Eggeling?L,Eikmanns?B,Kramer?R.1996,Construction?of?L-Lysine-,L-Threonine-,and?L-Isoleucin?Overproducing?Strains?of?Corynebacterium?Glutamicum.Ann?N?Y?Acad?Sci782:25-39)。

誠然，不是所有的蛋白質氨基酸（proteinogenic?amino?acids）并且僅極少數非天然氨基酸和D－氨基酸可以這種方式制備。由于對映異構體純的氨基酸的化學合成非常昂貴，因此已經開發了一系列酶學方法，其中一些方法已經可以達到每年生產數噸的規模。

所述方法的范圍包括從借助于酰基轉移酶、酰胺酶、酯酶、海因酶（hydantoinase）、氨基酸氧化酶和蛋白酶的動態外消旋物裂解到利用裂合酶、氨基轉移酶和脫氫酶的對映體選擇性合成(Schmid?A.et?al.(2002)“The?Use?of?Enzymes?in?the?Chemical?Industry?in?Europe”,Curr?Opin?Biotechnol13(4):359-366)。

除了對映體選擇性合成法之外，動態外消旋物裂解（dynamisch?kinetische?Racematspaltungen）也特別有效，其中不希望的對映異構體被原位外消旋化。在動態外消旋物裂解中，通過組合D-或L-氨基酸氧化酶與非選擇性化學還原初始亞氨基酸為主要氨基酸，也可以達到100％得率。然而，還原劑如NaBH₄必須以至少25倍當量過量應用，這樣導致這種方法非常昂貴(Enright?et?al.,“Stereoinversion?of?Beta-and?Gamma-Substituted?Alpha?Amino?Acids?Using?a?Chemo-Enzymatic?Oxidation-Reduction?Procedure”,Chemical?Communications(2003),(20),2636-2637.)

本領域通常已知氨基酸脫氫酶對α-酮酸的氨基化。然而無可否認所得離析物與例如相應的外消旋氨基酸相比更加昂貴許多倍。

然而，通過聯合氨基酸氧化酶與氨基酸脫氫酶，可以從氨基酸原位獲得相應的酮酸。當這兩種酶具有相反的對映體選擇性時，D-氨基酸可以完全轉變為L-氨基酸或者L－氨基酸完全轉變為D-氨基酸。從外消旋物開始，從中可以產生對映異構體純的化合物。

在此NADH共底物必須使用酶再生，因為其太昂貴以至于不能以化學計量的量應用。從其底物中釋放二氧化碳并因此使得反應不可逆的酶如甲酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶(脫羧化)是特別適用的(Hanson,R.L.et?al.“Enzymatic?Synthesis?of?L-6-Hydroxynorisoleucine”,Bioorganic&Medicinal?Chemistry(1999),7(10),2247-2252，及Nakajima?N.et?al.,“Enzymatic?Conversion?of?Racemic?Methionine?to?the?L-Enantiomer”,Journal?of?the?Chemical?Society,Chemical?Communications(1990),(13),947-8)。