[發明專利]噬菌體展示文庫及其應用和制備方法

有效

• 申請號: 201410043528.7
• 申請日: 2014-01-29
• 公開（公告）號: CN104805507B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 鐘南;陳剛;劉珂
• 申請（專利權）人: 杭州康萬達醫藥科技有限公司
• 主分類號: C40B40/10
• 分類號: C40B40/10;C12N15/63;C12N15/11;C12N1/21;G01N33/577;C12R1/19
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業平;張天舒

本發明提供一種噬菌體展示文庫及其應用和制備方法。所述噬菌體展示文庫包含一系列各自獨立地具有三維結構的抗體性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗體性重鏈CDR1、CDR2和CDR3結構域的重鏈、以及具有抗體性輕鏈CDR1、CDR2和CDR3結構域的輕鏈，其特征在于：所述抗體性重鏈CDR1、CDR2和CDR3結構域以及所述抗體性輕鏈CDR1、CDR2和CDR3結構域都具有強隨機突變性位點，所述強隨機突變性位點是位于所述多肽三維結構表面上的用于結合靶抗原的且非保守性的位點，所述強隨機突變性位點是由強隨機突變簡并密碼子編碼的氨基酸，并且所述強隨機突變簡并密碼子不包括終止密碼子。本發明的噬菌體展示文庫同時具有多樣性和篩選高效性。

技術領域

本發明涉及基因工程及分子生物學領域。具體而言，本發明涉及一種噬菌體展示文庫、該文庫在篩選特異性識別靶抗原的抗體中的用途以及制備該文庫的方法；本發明還涉及編碼該噬菌體展示文庫所展示的多肽的DNA組合物、用于構建所述噬菌體展示文庫的噬菌體質粒組合物、含有該噬菌體質粒組合物的宿主細胞庫、用于構建所述噬菌體展示文庫的引物及其用途以及包括所述噬菌體展示文庫的試劑盒。

背景技術

噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。噬菌體屬于單鏈DNA病毒，包括F1、fd和M13三類。噬菌體DNA能夠在細菌內滾環復制，細菌不被裂解，但生長速度減慢，同時可分泌出大量成熟的噬菌體顆粒。噬菌體的單鏈DNA長約7000bp，不同類型的噬菌體的一級結構極為相似，基因組編碼11種蛋白質，其中5種為結構蛋白，與噬菌體展示密切相關的是二種不同的結構蛋白pⅢ和pⅧ。噬菌體單鏈DNA被包裹在由大約2700-3000個主要衣殼蛋白pⅧ組成的管狀結構中。另外，次要衣殼蛋白pⅢ通過與大腸桿菌的F菌毛結合而引起感染，其是噬菌體感染宿主所必需的。

噬菌體展示平臺已經發展成熟，其通過將目標蛋白融合在pIII蛋白基因中的適當位置，從而在噬菌體表面展示目標蛋白(參見文獻“Bass,S.,Proteins,8:309(1990);Lowman and Wells,Methods:A Companion to Methods in Enzymology,3:205(1991)”)。由于融合有目標基因的pIII蛋白基因處于低表達狀態且野生型pIII蛋白仍在表達，因此能夠很好地維持噬菌體的感染性。與此相關的專利文獻如：美國專利No.5,723,286、美國專利No.5,432,018、美國專利No.5,580,717、美國專利No.5,427,908和美國專利No.5,498,530。

利用噬菌體文庫篩選針對靶蛋白、多肽或小分子的多肽或蛋白的技術已被廣泛研究（參見文獻“Tonikian,R.,Nature protocols,2:1368(2007)”）。其基本思路為：將設計好的噬菌體文庫與固相上的靶蛋白分子經過一定時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體，用洗脫的噬菌體感染宿主細胞，之后繁殖擴增，進行下一輪孵育洗脫，經過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。通過噬菌體ELISA，可從富集噬菌體輸出文庫中挑選出來具有期望結合特性的單克隆噬菌體。

噬菌體展示技術可以產生包含10¹⁰種以上不同展示蛋白的文庫，這與人體所能產生的抗體總數相近，從而使基于此技術的抗體篩選成為可能。然而，由于抗體的互補決定區全部可隨機產生10⁷⁰種以上的變化，因此，科學地設計抗體的噬菌體展示文庫將是決定篩選成功率和效率的關鍵因素。在這方面，已經有很多研究成果（例如，參見文獻“TomLinson,Nature Biotech.(2000),18:989-994”、“Barbas,PNAS9113809(1994)”、“Yelton,D E,J.Immunology,15511994(1995)”、“Jackson,J.R.,J.Immunology,15413310(1995)”和“Hawkins,R E,J.Mol.Biology,2261889(1992)”)。