[發明專利]一種用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料

有效

• 申請號: 201410043457.0
• 申請日: 2014-01-30
• 公開（公告）號: CN103751845A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 李威;阮狄克;白雪東
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍總醫院
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 周自清

1.一種用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，它是按以下方法制備的：

步驟一——化學萃取制備去細胞異體神經支架：在死亡不超過一小時的尸體切取周圍神經，置入PBS液4℃保存8-12小時，然后取出，剪除周圍神經干上附帶的脂肪、筋膜及血管等結構，保留完整的神經外膜，在26-28℃環境溫度下按以下步驟進行化學萃取去抗原處理：

⑴無菌蒸餾水中浸泡10-14小時；

⑵在5%Triton?X-100溶液中振蕩10-14小時；

⑶再次在無菌蒸餾水中浸泡3小時；

⑷在5%脫氧膽酸鈉溶液中振蕩10-14小時；

步驟二——培養自體脂肪干細胞作種子細胞：收集患者在清創手術中被清除的殘碎組織，選取其中無嚴重病變的淺層脂肪組織，清除血管、包膜等結締組織，PBS液反復沖洗，剪碎成1mm³大小組織塊，PBS液沖洗后，0.1%膠原酶37℃培養箱中消化1小時，過濾后離心，重懸于DMEM/F12（1:1）進行培養，過濾；細胞計數后1×10⁵/ml接種于25cm²培養瓶內培養；待細胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞進行傳代，利用直接免疫熒光標記法及流式細胞術檢測脂肪干細胞相對特異分子E-cadherin、CD105、CD44、CD29，對分選確定為脂肪干細胞繼續培養，傳代；

步驟三——細胞因子誘導的組織工程生物材料體外構建：于普通6?孔板中，將步驟二培養擴增的自體脂肪干細胞放置于步驟一制備的去細胞異體神經支架上，細胞濃度為2×10⁵/ml，放置于5%CO₂、37℃培養箱中進行培養，融合；12?小時后翻轉去細胞異體神經支架，更換脂肪干細胞懸液，再次置于5%CO₂、37℃培養箱進行培養，融合；然后在含有外源性許旺細胞源性神經營養因子的復合誘導液中誘導培養，每48-72小時更換一次復合誘導液，經26-30天完成誘導過程，即為可用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料。

2.根據權利要求1所述的用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，其特征在于，尸體周圍神經的取材優選股神經和坐骨神經。

3.根據權利要求2所述的用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，其特征在于，周圍神經取材規格為直徑7mm-8mm，長度80-100mm。

4.根據權利要求1所述的用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，其特征在于，步驟一制備去細胞異體神經支架的“無菌蒸餾水中浸泡→5%Triton?X-100溶液振蕩→無菌蒸餾水中浸泡→5%脫氧膽酸鈉溶液振蕩”四步程序重復進行共3次。

5.根據權利要求1所述的用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，其特征在于，步驟三所用復合誘導液含有H-DMEM培養基、10%FBS、100ng/ml?SDNF、10^-5M全反式視黃酸、200ng/ml?Heregulin-β。

6.根據權利要求1所述的用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，其特征在于，步驟三用作細胞因子的許旺細胞源性神經營養因子規格為5ml/500ml或10ug。

7.根據權利要求1所述的用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，其特征在于，經步驟三培養完成的組織工程生物材料放置凍存液中依次經過4℃30分鐘，-20℃2小時，-80℃，保存備用。

8.根據權利要求7所述的用于移植修復周圍神經缺損的組織工程生物材料，其特征在于，所述凍存液成分為：10%二甲基亞楓、10%胎牛血清、80%DMEM/F12。