[發(fā)明專利]基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-708檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410041281.5
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103773879A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 游攀;李娟;張忠英
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學附屬中山醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/34
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及MicroRNA，尤其是涉及一種基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-708檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞中的長約22個核苷酸的非編碼RNA分子，參與了在生物體中許多生理病理過程,通過調(diào)節(jié)基因表達,在細胞增殖、凋亡、生長發(fā)育、細胞分化、代謝等過程中發(fā)揮重要作用，具體表現(xiàn)為miRNA在細胞核內(nèi)經(jīng)過形成最初的初級轉(zhuǎn)錄本pri-miRNA到pre-miRNA，后轉(zhuǎn)運出細胞核，通過剪切形成成熟miRNA，通過與Ago蛋白等形成RISC（RNA誘導的沉默復合體），部分抑制或降解靶mRNA序列，參與基因表達調(diào)控（Bartel?DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and?function[J].Cell,2004,116(2):281-297）。

由于miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后判斷以及許多其他疾病狀態(tài)下扮演著重要角色，精確檢測其表達情況對于研究miRNA的作用具有重大意義。目前，檢測miRNA的方法主要有northern?blot技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)等。其中，northern?blot技術(shù)是RNA檢測的早期手段之一，但其特異性和敏感性低，如果樣本RNA含量低或存在降解，可能檢測不到；原位雜交技術(shù)用于檢測組織和細胞水平miRNA的分布情況，同時對miRNA進行半定量檢測，其不足地方在于不能準確檢測到低表達的miRNA；微陣列芯片技術(shù)是一種高通量的檢測技術(shù)，能同時檢測一種或多種樣本的大量的miRNA，但存在芯片制作費時，費力和標記成本高，檢測靈敏度和特異性低等問題。

實時熒光定量技術(shù)（RT-qPCR）是目前最普遍用于基因表達檢測的技術(shù)之一，具有簡便快速、敏感性高和特異性好等特點。目前，用于檢測miRNA的實時熒光定量PCR方法包括miRNA逆轉(zhuǎn)錄和下游的熒光定量PCR兩部分，其中逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)反轉(zhuǎn)錄引物的不同分為兩種：同聚物加尾法和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法；熒光定量PCR的檢測分為染料法和探針法，其中目前檢測miRNA的探針多為Taqman-MGB探針（一種適合于擴增短片段的熒光探針），由于成熟的miRNA具有片段短小的特點，要特異的檢測，探針法更有優(yōu)勢，在敏感性和特異性上優(yōu)于染料法。基于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物能特異識別，擴增成熟的miRNA序列，而miRNA的前體并未被擴增，Taqman-MGB探針檢測miRNA缺點在于合成價格貴，不利于推廣。

目前，AllGlo探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測皰疹病毒、乙型肝炎病毒基因突變（Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid?detection?of?the?hepatitis?B?virus?YMDD?mutant?using?AllGlo^TMprobes[J].Clin?Chim?Acta,2011，412(11-12)：1018-1021）、侵襲性曲霉菌病（Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The?establishment?and?evaluation?of?diagnostic?accuracy?of?AllGlo(TM)probe-based?techniques?for?invasive?aspergillosis[J].Zhong?hua?Nei?Ke?Za?Zhi,2010,49(2):142-145）、K-ras基因突變、強直性脊柱炎等檢測。

有研究報道表明在腫瘤研究方面，hsa-miR-708在腎細胞癌患者的組織學水平存在低表達。Sharanjot?Saini等通過實驗發(fā)現(xiàn)hsa-miR-708在腎細胞癌中發(fā)揮了抑癌作用，并且可以為臨床提供預后和治療新靶點（Saini,S.,Yamamura,S.,Majid,S.,Shahryari,V.,Hirata,H.,Tanaka,Y.,Dahiya,R[J].(2011).MicroRNA-708induces?apoptosis?and?suppresses?tumorigenicity?in?renal?cancer?cells.Cancer?research,71(19):6208-6219）。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于針對現(xiàn)有檢測miRNA方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的上述缺陷，提供基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-708檢測試劑盒。