[發(fā)明專利]基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410041173.8
• 申請(qǐng)日: 2014-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN103740851A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉文娟;唐晶;張忠英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12M1/34
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述hsa-miR-191-5p為一種人源性miRNA，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.15＇-CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG-3＇；

所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒，設(shè)有盒體、隔板、外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，外源性參照瓶、莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，外源性參照瓶?jī)?nèi)裝有外源性參照，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶?jī)?nèi)裝有莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶?jī)?nèi)裝有實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑。

2.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述外源性參照采用cel-miR-39，所述cel-miR-39為一種線蟲類miRNA,其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.25＇-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3＇；其工作濃度為5nmol。

3.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份：200單位/μL的MMLV酶、10m?mol?dNTP混合液、5×RT緩沖液、40單位/μL的RNA酶抑制劑、10m?mol的MgCl₂、1μmol的特異的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物、miRNA標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100n?mol；所述5×RT緩沖液由250m?mol?Tris-HCl、375m?mol?KCl、15m?mol?MgCl₂、50m?mol?DTT組成。

4.如權(quán)利要求3所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述miRNA的特異逆轉(zhuǎn)錄引物由hsa-miR-191-5p的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成；

所述hsa-miR-191-5p的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.35＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAGCTGCT-3＇；

所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.45＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3＇；

所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.55＇_-AACGCTTCACGAATTTGCGT_-3＇。

5.如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份：10×Taq緩沖液、10m?mol的MgCl₂、5單位/μL的Taq聚合酶、10m?moldNTP混合液、100mL無核酶水、10μmol特異正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探針；所述10×Taq緩沖液包括100m?mol?Tris-HCl，500m?mol?KCl。

6.如權(quán)利要求5所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的hsa-miR-191-5p檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述特異正向引物由hsa-miR-191-5p的特異引物、外源性參照cel-miR-39的特異引物和內(nèi)源性參照U6的特異引物組成；

所述hsa-miR-191-5p的特異引物的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.65＇-TACCAACGGAATCCCAAA-3＇；

所述外源性參照cel-miR-39的特異引物的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.75＇-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3＇；

所述內(nèi)源性參照U6的特異引物的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO.85＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇。