[發(fā)明專利]一種草莓細胞核懸液制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410040633.5
• 申請日: 2014-01-28
• 公開（公告）號: CN103776678A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金亮;李小白;王煒勇;馬廣瑩;劉慧春;鄒清成
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省蕭山棉麻研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及一種適用于流式細胞儀分析的草莓細胞核懸液制備方法。

背景技術(shù)

?栽培草莓（Fragaria×ananassa?Duch.），又名鳳梨草莓，屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，果實顏色鮮艷、柔軟多汁，富含糖、蛋白質(zhì)、維生素和花青素等營養(yǎng)物質(zhì)，是世界上廣泛栽培的重要經(jīng)濟作物，為世界七大水果之一。普遍認為目前草莓栽培品種的遺傳背景狹窄，新品種培育也因此受到限制。隨著研究深入，使用流式細胞儀進行植株倍性鑒定、基因組大小測定以及細胞周期等應(yīng)用和基礎(chǔ)研究對拓寬草莓育種基礎(chǔ)具有重要意義。而其中獲得適用于流式細胞儀分析的草莓細胞核懸液成為其中關(guān)鍵技術(shù)。

草莓葉片含有多酚類、其他次生代謝物質(zhì)，采用已報道的方法難以獲得適用于流式細胞儀分析的草莓細胞核懸液，或相關(guān)方法繁瑣、含有對人體有害的試劑，這些都阻礙了相關(guān)研究的進行。為了對草莓更深入的研究，必須找到一種高效、快捷而又經(jīng)濟的草莓細胞核懸液制備方法，這樣才能更有利于草莓相關(guān)研究的開展。

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明目的是提供一種適用于流式細胞儀分析的草莓細胞核懸液，該方法高效、快捷、經(jīng)濟。

?本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

?一種草莓細胞核懸液制備方法，步驟如下：

1）取草莓嫩葉50?mg，置于塑料培養(yǎng)皿中加入1?ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成：14.8g/L二水合檸檬酸三鈉，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及體積濃度0.5%吐溫20；

2）使用刀片在提取液中切碎草莓嫩葉，然后收集提取液經(jīng)350?目尼龍網(wǎng)過濾，獲得草莓細胞核懸液。

在步驟2）所述的草莓細胞核懸液中加入DNA熒光染料碘化丙錠(?propidium?iodide?,?終濃度為50μg/?ml)，?及Rnase?(終濃度為50μg/?ml)，染色后的提取液用于流式細胞儀的檢測。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在于：

1）最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；

2）提取液成分簡單，只有三種，均為常規(guī)實驗室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；

3）步驟簡單，無需離心，節(jié)省了時間提高了效率，可以在短時間內(nèi)獲得細胞核懸液用于流式細胞儀檢測；

4）可獲得較高質(zhì)量細胞核懸液用于流式細胞儀檢測。

附圖說明

??圖1?采用本發(fā)明制備的草莓細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖；

??圖2?采用兩步法制備的草莓細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖。

具體實施方式

?下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于此：

實施例1

??一、試劑的配置

?1）細胞核提取液配置：稱取1.47g二水合檸檬酸三鈉、1g聚乙烯吡咯烷酮K-30于一干凈的250ml燒杯中，加入體積濃度0.5ml吐溫20；加超純水定容到100ml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存?zhèn)溆谩?/p>

?2）熒光染料配置：稱取25mg碘化丙錠、25mg核糖核酸酶于一干凈的250ml燒杯中加超純水定容到50ml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存?zhèn)溆谩?/p>

??二、草莓細胞核懸液提取方法

（1）取草莓嫩葉（約50?mg），置于塑料培養(yǎng)皿中加入1?ml提取液。（2）使用鋒利剃須刀片在提取液中切碎葉片；（3）收集提取液經(jīng)350?目尼龍網(wǎng)過濾，獲得草莓細胞核懸液；（4）過濾后的提取液中加入DNA熒光染料碘化丙錠（終濃度為50μg/?ml）及Rnase?（終濃度為50μg/?ml）。染色后的提取液上流式細胞儀檢測。

?草莓細胞核懸液的流式細胞儀檢測

?采用過FACSCalibur?流式細胞儀（美國Becton-Dickinson?公司），在488?nm?激光的激發(fā)下發(fā)出桔紅色熒光，由FL2?通道檢測出熒光強度。從隨機軟件Cell?Quest?Pro獲取數(shù)據(jù),并通過ModFit?LT軟件顯示直方圖（橫坐標以DNA相對含量反映熒光曲線的面積縱坐標為細胞核次數(shù)），結(jié)果見圖1。本發(fā)明制備的草莓細胞核懸液不僅適用FACSCalibur?流式細胞儀，也適用于?Quanta?SC（美國貝克曼庫爾特公司）?等目前市場是所有具有488nm激光器的流式細胞儀。

?對比例1：采用已報道的兩步法（Dolezel?J?,?Gohde?W.?Sex?determination?in?dioecious?plants?Melandrium?album?and?M.?rubrum?using?high-resolution?flow?cytometry.?Cytometry?,?1995?,19?:103?-?106.）提取草莓細胞核懸液經(jīng)流式細胞儀檢測的直方圖，結(jié)果見圖2。熒光峰不明顯，碎片較多，無法用于相關(guān)研究。