[發明專利]一種齊口裂腹魚cGnRH Ⅱ基因克隆的方法

在審

• 申請號: 201410040443.3
• 申請日: 2014-01-25
• 公開（公告）號: CN103805596A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 楊世勇;王韜;李志瓊
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種齊口裂腹魚cGnRH?II基因克隆的方法，屬于基因克隆技術領域。?

背景技術

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing?hormone，GnRH)，又稱促黃體素釋放激素(1uteini-zing?hormone-releasing?hormone，LHRH)，是由下丘腦分泌的十肽激素，是動物生殖過程中最重要的激素之一。GnRH脈沖式釋放刺激垂體促性腺激素(GTH)的合成和分泌從而調節性激素的分泌，是性腺軸系的原動力，對性腺還可能具有直接作用。GnRH已被證明是下丘腦一垂體一性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadalaxis，HPG)的關鍵信號分子。GnRH家族中最保守的是chicken?GnRH?II(chicken-II-type?Gonadotropin-releasing?hormone，cGnRH?II)，它隨同其他分子形式的GnRH共同存在于大多數脊椎動物中，存在于所有的有頜類包括人類中。?

近年來，隨著PCR技術的快速興起和成熟，cDNA末端快速擴增技術(Rapid?Amplification?of?cDNA?Ends，RACE)為簡潔方便的基因克隆發展道路指出了新的方向。RACE是利用PCR技術由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA末端的方法，又稱為錨定或單邊PCR，一般有兩種RACE方法，分別用于擴增3′端或5′端。5′RACE比3′RACE更具有挑戰性，其特異性較低，產物可能是單一產物、多個產物，甚至是不能分辨的連續條帶。最終質量取決于擴增所使用錨定引物的特異性、目的mRNA5端結構的復雜度和豐度及產物的長度等因素。可利用巢式引物擴增(最多進行三輪巢式擴增)，增加逆轉錄保溫溫度和PCR退火溫度，降低擴增反應中的鎂離子濃度等方法增加5′RACE的特異性。SMART反轉錄酶法RACE技術比較而言是中最為成熟的。但是對于不同的試驗對象仍然需要一定的改進。DTT是一種蛋白質保護劑，此外還有解開mRNA鏈5′端高級結構的作用。RACE技術的成功應用已經顯示出它是一種高效簡便的技術手段。它除了在獲得全長cDNA序列方面的應用外，隨著生物學各項技術的交叉利用，對RACE技術的改良和發展，伴隨著優化條件下PCR擴增效率和忠實度的提高以及PCR產物克隆技術的進步，相信RACE技術在基因克隆以及RNA剪接、基因家族和基因表達變化等多項領域。?

目前，所采用的技術有：RT-PCR克隆：是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)以及分子克隆相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的基因片段，將合成的目的基因片段克隆到載體細胞基因?中，然后用質粒PCR產物測序。該技術缺點在于：克隆未知基因的方法比如通過篩選文庫等有個共同的弊病，即實驗操作繁瑣，周期較長、工作量繁重，且不易得到全長cDNA序列。另外，也有采用分段PCR克隆法：將目的基因分成幾段來分別克隆，然后做亞克隆測序拼接。成本高，工作量大耗時，一個基因分成幾段就需要做幾次克隆，然后再做序列接拼。該技術缺點為：克隆未知基因的方法比如通過篩選文庫等有個共同的弊病，即實驗操作繁瑣，周期較長、工作量繁重，且不易得到全長cDNA序列。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種高效、方便的獲取齊口裂腹魚chicken?GnRH?II基因的全長序列的方法，填補了該基因在齊口裂腹魚上的空白，為進一步研究齊口裂腹魚的該基因奠定了基礎。?

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。?

一種齊口裂腹魚cGnRH?II基因克隆的方法，具體包括以下步驟：?

(1)腦組織RNA的提取：總RNA提取采用TaKaRa試劑，具體步驟如下：?

(1a)從-80℃冰箱中取出凍存組織，取100mg左右，放入高溫滅菌處理過的研缽中，加入液氮，磨成粉末；?

(1b)向1.5ml離心管于加入1ml預冷的Trizol裂解液，迅速把組織粉末放置于離心管中，劇烈振蕩5min，使其充分溶解；?

(1c)4℃條件下12000rpm離心10min，然后吸取上清的Trizol裂解液至新的1.5ml離心管中，冰上放置5分鐘；?

(1d)吸取0.2ml氯仿加入離心管中，激烈振蕩15s，室溫靜置5min，4℃條件下13000rpm離心10min，將上層水相轉移至新的EP管中；?

(1e)加入0.5ml異丙醇，顛倒數次混勻，冰上沉淀10分鐘；?