[發(fā)明專利]HLA-B*58:01等位基因檢測方法及其試劑盒無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410040172.1 | 申請日： | 2014-01-27 |
| 公開（公告）號： | CN103805701A | 公開（公告）日： | 2014-05-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉志文;肖偉明;闕秋華;孫祖勇 | 申請（專利權(quán)）人： | 希斯奇生物醫(yī)藥（上海）有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 上海思微知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31237 | 代理人： | 許曉琳 |
| 地址： | 200233 上海市徐匯區(qū)*** | 國省代碼： | 上海;31 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | hla 58 01 等位基因 檢測 方法 及其 試劑盒 | ||
1.一種HLA-B*58:01等位基因檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）提供包括待測樣品、核酸擴(kuò)增體系和熒光檢測體系的混合物；
（2）通過擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增待測樣品中的靶多核苷酸；
（3）使所述熒光檢測體系中的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸序列間接結(jié)合；
（4）測定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在及其相對量；
所述核酸擴(kuò)增體系由如下組分組成：耐熱DNA聚合酶、2’-脫氧核苷三磷酸、能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物a和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物a，能夠與靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物b和能夠與靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物b；所述熒光檢測體系是能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的兩條寡核苷酸探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸擴(kuò)增體系和熒光檢測體系共3組，其中：
核酸擴(kuò)增體系Ⅰ中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物a和反向引物a分別為引物1和引物2，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系I中所使用的寡核苷酸探針為探針1和探針4；
核酸擴(kuò)增體系Ⅱ中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物a和反向引物a分別為引物3和引物4，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系II中所使用的寡核苷酸探針為探針2和探針4；
核酸擴(kuò)增體系Ⅲ中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物a和反向引物a分別為引物5和引物6，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物b和反向引物b分別為引物7和引物8，并且熒光檢測體系III中所使用的寡核苷酸探針為探針3和探針4；
各引物和探針具體組成如下：
引物1：5’-CCACGAGTTTCACTTCTTCTC-3’，
引物2：5’GCGACACTGATTGGCTTCT-3’，
引物3：5’-CTGGAGAACGGGAAGGAG-3’，
引物4：5’-CAAGGGAGGGCGACATT-3’，
引物5：5’-CTCCAGCCAGCGACAGTGC-3’，
引物6：5’CGCGAAACATCCCAATCAA-3’，
引物7：5’-TTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3’，
引物8：5’-CGATCCTGAGACTTCCACAC-3’；
探針1：5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，
探針2：5’-AAGGAGACGCTGCAGCGCGC-3’，
探針3：5’-ATCCCCATTACCCAGGCCTTTCC-3’，
探針4：5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)是重復(fù)35-45次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）中，先確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)數(shù)；然后將上述測定的閾循環(huán)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的靶多核苷酸的閾循環(huán)數(shù)相比較，以確定樣品中靶多核苷酸的相對量，從而判斷樣品包含靶多核苷酸基因的純合型與雜合型。
5.一種用于HLA-B*58:01等位基因檢測的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：（1）分別裝有反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3、EZ?Taq混合液、標(biāo)準(zhǔn)液1、標(biāo)準(zhǔn)液2的多個密封離心管，（2）分隔并集中包裝這些離心管的試劑盒；其中：
反應(yīng)液1由如下組分組成：由PCR反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物1和引物2，寡核苷酸探針為探針1；用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4；
反應(yīng)液2由如下組分組成：PCR反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物3和引物4，寡核苷酸探針為探針2；用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4；
反應(yīng)液3由如下組分組成：PCR反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物5和引物6，寡核苷酸探針為探針3；用于靶多核苷酸擴(kuò)增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4；
EZ?Taq混合液：主要成份為熱啟動Taq酶；
標(biāo)準(zhǔn)液1：純合型HLA-B*58:01基因組DNA；
標(biāo)準(zhǔn)液2：雜合型HLA-B*58:01基因組DNA；
各引物和探針具體組成如下：
引物1：5’-CCACGAGTTTCACTTCTTCTC-3’，
引物2：5’GCGACACTGATTGGCTTCT-3’，
引物3：5’-CTGGAGAACGGGAAGGAG-3’，
引物4：5’-CAAGGGAGGGCGACATT-3’，
引物5：5’-CTCCAGCCAGCGACAGTGC-3’，
引物6：5’CGCGAAACATCCCAATCAA-3’，
引物7：5’-TTCAGGGTGAGTCTATGGGA-3’，
引物8：5’-CGATCCTGAGACTTCCACAC-3’；
探針1：5’-CCCAACCTATGTCGGGTCCTTCTTC-3’，
探針2：5’-AAGGAGACGCTGCAGCGCGC-3’，
探針3：5’-ATCCCCATTACCCAGGCCTTTCC-3’，
探針4：5’-TGATGCAATCATTCGTCTGTTTCCC-3’。
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