[發明專利]一種新型海洋微生物低溫堿性蛋白酶脫色方法

有效

• 申請號: 201410038979.1
• 申請日: 2014-01-26
• 公開（公告）號: CN103789290A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 王芳;孫謐;徐甲坤;劉均忠
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12N9/52
• 分類號: C12N9/52
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 楊小蓉;史和初

技術領域

本發明涉及海洋微生物領域，特別是涉及一種新型海洋微生物低溫堿性蛋白酶MP脫色方法。?

背景技術

蛋白酶是三大工業酶之一，其產量達到世界酶制劑產量的60%。由于蛋白酶能有效地去除及分解蛋白，所以其被大量用于洗滌劑行業中。近年來，隨著綠色、環保、節能及低碳生活理念的深入，低溫洗滌已成為一個趨勢。低溫堿性蛋白酶MP來自于海洋微生物，具有低溫高效的催化性能。但由于蛋白酶發酵液中含有色素，影響了其應用外觀品質。離子交換樹脂自產生以來,已經廣泛應用于食品工業、醫藥工業以及環境工程的富集、分離、純化及脫色工藝中。?

發明內容

本發明的目的在于發明人長期開發研究海洋微生物酶的的應用研究及其生產實踐,開發提供一種新型海洋微生物低溫堿性蛋白酶MP脫色方法。?

本發明提供一種新型海洋微生物低溫堿性蛋白酶MP（屬海洋微生物低溫堿性蛋白酶,或稱低溫堿性蛋白酶MP,簡稱蛋白酶MP）脫色方法,包括下列步驟：?

1)D352陰離子交換樹脂的處理?

首先將D352陰離子交換樹脂(簡稱D352樹脂)（D352購自上海勁凱樹脂有限公司）用4wt%的HCl浸泡2-4h,后用去離子水洗至中性;再用4wt%NaOH浸泡6-8h，去離子水洗至中性，裝于離子交換柱中（例如Φ46mm×305mm玻璃離子交換柱等，北京欣維爾玻璃儀器有限公司）,所述D352陰離子交換樹脂為大孔型聚苯乙烯帶有伯氨基的弱堿型陰離子交換樹脂。?

2）低溫堿性蛋白酶MP的制備?

將YS-80菌株接種于含有1.2wt%蛋白胨、2.4wt%酵母粉、0.4wt%甘油、2.5wt%NaCl的GB培養基中,于18℃連續培養48小時，此時檢測發酵液中蛋白酶酶活可達到5000U/ml;然后，在4℃條件下，離心去除菌體，保留上清液,再用超濾濃縮的方式制備不同酶活的低溫堿性蛋白酶MP酶液;?

3）低溫堿性蛋白酶MP的脫色?

將步驟2制備的低溫蛋白酶MP酶液流過步驟1的陰離子交換柱進行脫色，控制流速為4—8BV/ml,優選為6BV/ml;pH值為5—9,優選為6—7;溫度為20—40℃,優選為30℃。?

本發明提供一種新型海洋微生物低溫堿性蛋白酶MP（陰離子交換樹脂）脫色方法中,脫色率的測定：?

配制濃度為1wt%的低溫蛋白酶MP酶液，進行可見-紫外全波長掃描，發現在420nm有較強的吸收峰，所以選擇420nm作為檢測波長，測定酶液的吸光度，并按下式計算脫色率。?

R=(A-A₀)／A₀×100?

式中：?

R—脫色率；?

A₀—脫色前吸光度；?

A—脫色后吸光度。?

蛋白酶酶活的測定（Folin-酚法）：?

準確稱取干酪素1.0g，用少許NaOH或乳酸潤濕，溶于50mmol/L一定pH的緩沖液中，調pH，定容至100ml，配成10g/L的酪素溶液。酪素溶液與適當稀釋比例的酶溶液預熱10min后，各取1.0ml混合于30℃恒溫水浴中，準確反應10min，用0.4mol/L三氯乙酸2.0ml終止反應。對照為先加三氯乙酸使酶失活再加酪素。將反應液過濾，取1.0ml于0.4mol/L?Na₂CO₃5ml混合，再加1.0ml?Folin試劑，震蕩混勻，40℃顯色20min，于680nm波長處比色。蛋白酶活力以1ml酶液1min水解酪素產生1μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位，以U/ml表示。?

蛋白含量的測定：采用Lorry法。?