[發(fā)明專利]一種檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410038662.8
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN103789433B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發(fā)明（設計）人: 姜樹坤;王嘉宇;張鳳鳴;劉丹;白良明;孫世臣;丁國華;王彤彤;張喜娟;姜輝
• 申請（專利權）人: 黑龍江省農業(yè)科學院耕作栽培研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
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1.一種檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記，其特征在于，該分子標記為IPS1-1，該片段如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其中，該分子標記的核苷酸序列如下：

IPS1-1的上游引物序列為：5′

-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3′

IPS1-1的下游引物序列為：5′-ACAACATTCCCCTGGCAAGT--3′。

2.根據權利要求1所述的檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記，其特征在于，所述分子標記IPS1-1由東北粳稻′沈農265′和云南地方品種′麗江新團黑谷′構建的重組自交系群體基因進行擴增獲取。

3.根據權利要求2所述的檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記，其特征在于，在所述重組自交過程中，所述分子標記IPS1-1與IPS1共分離。

4.一種檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記的方法，其特征在于，其過程為：

步驟a，DNA提取；具體為：

步驟a1，取長度為10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量離心管(EP)中；

步驟a2，加入預熱至65℃的CTAB抽提液600μL；

步驟a3，輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態(tài)，放于60℃的水浴30-60min，期間每5min輕輕倒轉離心管使之分散均勻；

步驟a4,取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，室溫振蕩，充分混勻，然后于臺式冷凍離心機上10000rpm離心10min，取上清液轉入另一離心管中；

步驟a5，重復3-4次，直至中間沒有蛋白層為止；

步驟a6，將上清液逐滴加入2倍體積的-20℃預冷的無水乙醇中，-20℃放置30min以上；

步驟a7,此時可見DNA成棉絮狀小團漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去殘液，在超凈工作臺上吹干；

步驟a8,用100μL的TE緩沖液回溶待用；

步驟a9，取1.5μL用于PCR擴增；

步驟b，PCR擴增；PCR反應體系為15μL，含50mMKCl，10mMTris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM?MgCl2，200μM?each?of?dNTPs，0.2μM?of?each?primer，5％(v/v)dimethyl?sulfoxide?and0.5U?Taq?DNA聚合酶；

步驟c，PCR產物檢測；

擴增產物中加入上樣緩沖液，取8μL上述樣品于1.5％的瓊脂糖凝膠，在100V的恒定電壓下電泳1小時，利用凝膠成像系統(tǒng)成像觀察；

步驟d，獲取IPS1基因。

5.根據權利要求4所述的檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記的方法，其特征在于，在上述步驟a2中，所述CTAB抽提液包括2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LnaCl。

6.根據權利要求5所述的檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記的方法，其特征在于，在上述步驟a8中，所述TE緩沖液包括10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0。

7.根據權利要求4或5所述的檢測水稻穗結構基因IPS1的特異分子標記的方法，其特征在于，上述步驟b中，采用ABI-9700進行擴增，反應程序為94℃預變性5min；每個循環(huán)94℃預變性1min，550℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸8min。