[發明專利]一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法

有效

• 申請號: 201410037629.3
• 申請日: 2014-01-26
• 公開（公告）號: CN103798141A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張琳;夏宜平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

技術領域

本發明是關于植物快速繁殖技術領域，特別涉及一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法。

背景技術

百合胚性愈傷組織再生體系相比其他再生體系如芽再生體系，具有最高的增殖率和擴繁率，對優良種質的保存有重要意義。此外，百合胚性愈傷組織再生體系也是百合遺傳轉化體系的決定性基礎，進而影響百合的基因工程改良。

目前建立百合愈傷再生體系多以田間鱗莖的鱗片為外植體，其缺陷是鱗莖由于長期處于土壤環境中，攜帶病菌多，使組織培養消毒要求嚴格，污染率較高。此外，當需要建立野生百合種質的實驗室離體體系時，以鱗莖為外植體，只能采用花期后挖取種球，其突出的不足有二：首先，野生百合位置的確定和種類的辨認很大程度是依靠醒目的花器官及其特征，花期后野生百合地上部分已全部或部分枯萎，尤其是花器官的衰敗和花被片脫落使其種類難以辨認，易造成種質資源的混淆；其次，挖取種球等同于對野生資源完全的采集，對于珍稀瀕危種類更是難以回復的破壞。

發明內容

本發明的主要目的在于克服現有技術中的不足，提供一種污染率低、愈傷誘導率高、愈傷團塊大、愈傷胚性好、再生能力強、增殖率高，且對種質資源的破壞小的建立百合胚性愈傷再生體系的方法。為解決上述技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種以花梗為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，包括以下步驟：

步驟一：材料采取：

在百合花期，取百合長0.5～2.0cm的（幼嫩）花蕾，花蕾帶長1～1.5cm的花梗，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏1周后，再進行后續操作；

步驟二：愈傷誘導培養基配置：

愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige?and?Skoog,1962)為基本培養基，即采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有30g/L的蔗糖、5g/L瓊脂、0.25mg/L6-芐氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.25～1.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，愈傷誘導培養基溶液的pH值為5.8；

將配置好的愈傷誘導培養基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進行分裝，即將愈傷誘導培養基溶液倒入（玻璃或塑料）培養皿中，待愈傷誘導培養基溶液凝固成愈傷誘導培養基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導培養基的培養皿包裹好，放在無菌潔凈環境（如組培室）下存放；

步驟三：外植體接種及愈傷組織誘導：

將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5～30min，再在流水下沖洗0.5～2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進行消毒接種；

消毒方法如下：用添加了0.1%v/v吐溫的1%w/v的次氯酸鈉溶液，將清洗干凈的花蕾進行表面消毒8～15min，然后用無菌水沖洗3遍；

消毒后進行接種：用鑷子和解剖刀將花蕾上的花梗切下，將長1cm的花梗接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分產生新鮮切口，然后用解剖刀在其表面處理出劃痕、切口或創傷后接種，并使創傷面接觸培養基表面；將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養8～40天，完成愈傷組織的誘導，出現愈傷組織團塊；

步驟四：小植株再生：

外植體在愈傷誘導培養基上培養40～70天后，開始分化再生出小植株，然后將外植體轉接到新鮮的愈傷誘導培養基上，在照度為1800lux、12h光照/12h黑暗的光照條件下，培養90～120天后，在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團塊上分離下來，轉入繼代培養基培養；

小植株在繼代培養基上生長4周后（平均直徑達到1cm以上），可進行步驟六中的出瓶種植，或者不出瓶，進行步驟五中的繼代以維持百合離體鱗莖再生體系，再進行步驟六中的出瓶種植；

所述繼代培養基以MS培養基(Murashige?and?Skoog,1962)為基本培養基，即每升繼代培養基中添加有4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、4～8g/L瓊脂、0～0.2mg/L6-芐氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0～0.2mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic?acid,NAA），繼代培養基的pH值為5.8；（α-萘乙酸不是必需的，但一定濃度的萘乙酸將有利于小植株根系生長，6-芐氨基腺嘌呤不是必需的，但一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤將有利于小植株增殖）