[發(fā)明專利]β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌及其在轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410037538.X
• 申請(qǐng)日: 2014-01-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103865804A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇龍;覃榮燕;區(qū)善芬;許譯中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 玉林師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12P7/22;C12R1/69
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌及其在轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

白藜蘆醇是中草藥虎杖中的一種天然活性物質(zhì)，化學(xué)名稱為芪三酚(即3，5，4’－三羥基－l，2一二苯基乙烯)，是一種活性多酚物質(zhì)，分子式為C₁₄H₁₂O₃?；⒄戎邪桌杼J醇往往以葡萄糖苷(即虎杖苷)的形式存在，虎杖苷在腸道中糖苷酶的作用下可分解為白黎蘆醇，而發(fā)揮藥理作用。白黎蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗過(guò)敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化和防治冠心病、缺血性心臟病、高血脂癥等作用，白黎蘆醇已被列為抗心血管、抗癌最有前途的藥物之一，它是繼紫杉醇以后的又一綠色抗癌物質(zhì)。白黎蘆醇具有獨(dú)特的化學(xué)和生理活性，在護(hù)膚品中可起到多重作用，例如抗氧化、抗衰老、抗紫外線、增白及保濕等，因而對(duì)多種因素造成的皮膚老化(皺紋和色素沉著)都有獨(dú)到的功效?，F(xiàn)代方法獲得白黎蘆醇主要有直接從植物中提取、化學(xué)合成法、復(fù)合酶酶解法和生物合成法等。目前，有人用酸堿水解法或改性纖維素酶解法對(duì)虎杖苷進(jìn)行分解，但是酸堿會(huì)造成環(huán)境污染還降低產(chǎn)量，而改性纖維素酶法成本較高、工藝較為復(fù)雜，因此均不利于推廣應(yīng)用。?

國(guó)內(nèi)近年來(lái)β-葡萄糖苷酶的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，已由過(guò)去研究β-葡萄糖苷酶的簡(jiǎn)單提取到現(xiàn)在的產(chǎn)酶條件優(yōu)化以及粗酶液的純化。雖然β-葡萄糖苷酶基因已成功克隆表達(dá)，新構(gòu)建的工程菌也已應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，但仍然存在很多不足，如：工藝復(fù)雜、成本過(guò)高，從而限制了其進(jìn)一步發(fā)展。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能高效轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇的β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌及其在轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇中的應(yīng)用。?

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌，保藏編號(hào)為CCTCC?NO.M2013633，分類命名為米曲霉（Aspergillus?oryzae）HHL。?

上述β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌在轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇中的應(yīng)用。?

利用上述β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇的方法，包括以下步驟：?

（1）種子制備：將保存的米曲霉HHL孢子接種于斜面培養(yǎng)基上，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，獲得孢子，用無(wú)菌水洗脫孢子獲得孢子懸浮液，將孢子懸浮液接入搖瓶發(fā)酵?培養(yǎng)基；斜面培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基是產(chǎn)酶優(yōu)化培養(yǎng)基；?

（2）轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇：在溫度為35℃、pH7.0、裝液量為100ml/250ml、接種量為1%、轉(zhuǎn)速180r/min的條件下發(fā)酵120h，加入10%虎杖液，在溫度為50℃、pH5.0的條件下反應(yīng)5h。?

孢子懸浮液濃度為1.0×10⁸個(gè)/ml。?

虎杖液按以下操作制備：取10g虎杖按質(zhì)量體積比1:10用蒸餾水浸泡20分鐘，然后小火煮沸30分鐘左右，冷卻后用8層紗布過(guò)濾，依法重復(fù)煮三次；合并濾液，最后用蒸餾水定容至100ml，得虎杖煮提液。?

產(chǎn)酶優(yōu)化培養(yǎng)基配方為麩皮汁10%、酵母膏0.5%、硫酸鎂0.1%、磷酸氫二鉀0.1%、抗壞血酸0.1%。?

發(fā)明人以虎杖為碳源從自然界中篩選到一株β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌（保藏編號(hào)為CCTCC?NO.M2013633，分類命名為米曲霉（Aspergillus?oryzae）HHL），該菌能高效轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇。據(jù)此，發(fā)明人建立了一種利用上述β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇的方法，采用產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別從碳源、氮源、接種量、底物濃度、裝液量、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、轉(zhuǎn)化pH等幾方面進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析優(yōu)化，確定微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件及微生物轉(zhuǎn)化得到產(chǎn)物白藜蘆醇的最佳條件，一方面可在溫和條件下水解白藜蘆醇苷，避免了傳統(tǒng)方法導(dǎo)致有效成分損失的缺陷，有效地提高了產(chǎn)量；另一方面利用現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程技術(shù)和酶工程技術(shù)使虎杖的有效成分白藜蘆醇苷在體外可控條件下實(shí)現(xiàn)規(guī)模轉(zhuǎn)化，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。應(yīng)用本發(fā)明可為大量工業(yè)化生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、白藜蘆醇提供一條可行途徑，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景廣闊。?

附圖說(shuō)明

圖1是米曲霉HHL產(chǎn)酶條件優(yōu)化—發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果圖。?

圖2是米曲霉HHL產(chǎn)酶條件優(yōu)化—碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果圖。?

圖3是米曲霉HHL產(chǎn)酶條件優(yōu)化—氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果圖。?

圖4是米曲霉HHL產(chǎn)酶條件優(yōu)化—磷酸二氫鉀濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果圖。?