[發明專利]一種利用RNA干擾技術防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法

有效

• 申請號: 201410037220.1
• 申請日: 2014-01-26
• 公開（公告）號: CN103751807A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 夏曉翠;魏太云;周冰峰
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P31/14;C12N15/70;C12N15/113;C12N15/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種RNA干擾技術防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，屬于昆蟲病害防治領域。

背景技術

中華蜜蜂（Apis?cerana?cerana,?簡稱中蜂），是我國土生土長的蜂種。蜜蜂很容易受到各種病害的威脅，病原物包括有病毒、細菌、真菌和原生動物等。目前，在蜜蜂中已發現的病毒病至少有22種。其中，囊狀幼蟲病是危害較嚴重的一種病毒病。中華蜜蜂囊狀幼蟲病最早是1972年在廣東省發現的，之后迅速蔓延全國。中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒感染蜜蜂幼蟲后，使其不能化蛹，大量的液體和病毒粒子聚集于病蟲體內，且蟲體顏色由珍珠白色逐漸變為淺黃色，在死亡之后，蜜蜂蟲體會逐漸變得干枯，形成一個暗褐色如龍船狀的鱗片，該病害對中華蜜蜂構成了嚴重的威脅，往往會造成蜂群、甚至整個蜂場的蜜蜂死亡。

目前，尚無治愈蜜蜂囊狀病的方法和特效藥物，主要以預防為主。主要通過選育抗病品種、適時換王、加強飼養管理和一些中草藥來綜合防治該病毒病。化學藥物治療造成蜂產品藥物殘留的食品安全問題，中草藥治療治標而不治本。RNA干擾技術（RNA?interference,?RNAi）是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。由于其特異性和有效性，已被認為是一種重要的特異性基因阻斷技術，目前RNAi已成為疾病防治和藥物篩選的重要研究手段。本發明利用中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒自身復制基因合成雙鏈RNA，采用RNA干擾方法來防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病。

發明內容

本發明的目的在于提供一種RNA干擾技術防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，本發明的雙鏈RNA是用大腸桿菌誘導表達的，成本低，并且對中華蜜蜂囊狀幼蟲病的防治具有良好的治愈效果。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用RNA干擾技術防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，其步驟包括以下：

（1）收集患中華蜜蜂囊狀幼蟲病的幼蟲或蛹放置-80℃冰箱保存；

（2）中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒復制基因-RNA依賴的RNA聚合酶基因的擴增：采用Trizol法提取患病幼蟲的總RNA，用RdRp基因的下游引物進行反轉錄合成cDNA，PCR擴增目的基因片段，將該基因片段連接到PMD18-T載體，挑取含有該基因片段的單菌落送至華大基因公司進行序列測定；

（3）dsRdRp原核表達載體的構建，將（2）中擴增的目的片段，在T4連接酶的作用下連接至L4440載體，16℃連接過夜；將T4酶連接產物轉入HT115感受態細胞中，涂布于含有100?μg/mL氨芐抗生素的LB固體培養基上；

（4）dsRdRp的誘導表達：將（3）中陽性克隆接種于LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD₅₉₅?=?0.5-0.6，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷，即IPTG進行誘導，處理后37℃繼續震蕩培養4?h，收集菌液，采用CTAB法提取dsRdRp；

（5）dsRdRp的大量表達并添加懂到飼料中飼喂給蜜蜂幼蟲。

所述的LB固體培養基配方為：胰蛋白胨，10?g；酵母提取物5?g；氯化鈉，10?g；瓊脂，15?g；用去離子水定容至1?L，121℃蒸汽滅菌20?min；所述LB液體培養基配方為：胰蛋白胨，10?g；酵母提取物5?g；氯化鈉，10?g；用去離子水定容至1?L，121℃蒸汽滅菌20?min。

本發明的優點在于：用RNA干擾方法對中華蜜蜂囊狀幼蟲病進行防治，該方法采用細菌原核表達dsRNA，成本低，且選用的基因片段RdRp是病毒復制的基因，沉默該基因的表達，抑制中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒的復制，特異性強。

附圖說明

圖1?RNA依賴的RNA聚合酶基因PCR的擴增。

圖2?dsRdRp的原核表達結果。

圖3中華蜜蜂幼蟲的化蛹率和羽化率。其中dsGFP為對照組；dsRdRp（0.5）為0.5?μg/ml的dsRdRp；dsRdRp（0.2）為0.2?μg/ml的dsRdRp；dsRdRp（0.8）為0.8?μg/ml的dsRdRp。

具體實施方式

實施例1

收集患中華蜜蜂囊狀幼蟲病的幼蟲或蛹放置-80℃冰箱保存。