[發明專利]一種人源抗蟲基因及其編碼的抗Cry1B毒素獨特型單鏈抗體與應用

有效

• 申請號: 201410037175.X
• 申請日: 2014-01-26
• 公開（公告）號: CN103773775A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 劉賢金;徐重新;張霄;劉媛;謝雅晶;張存政;余向陽;王冬蘭
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/70;C07K16/12;A01N47/44;A01P7/04
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 孫忠浩

技術領域

本發明涉及基因工程和生物防治領域，特別是一種人源抗蟲基因及其編碼的抗Cry1B毒素獨特型單鏈抗體與應用。

背景技術

目前全球廣泛用于生物防治病蟲害的殺蟲基因是蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis，Bt）的Bt毒素基因（例如Cry1B、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F等）。蘇云金芽孢桿菌是一種昆蟲性病原細菌，其產生的Bt毒素對多種農、林害蟲都有具有特異性毒殺作用。到1987?年比利時植物遺傳系統公司(Plant?Genetic?Systems)就在世界上首次報道了轉Bt?基因抗蟲煙草獲得成功，到現在，Bt?基因已經被轉到玉米、水稻、棉花、番茄、馬鈴薯、煙草等世界主要農作物中。據2012?年國際生物技術應用服務組織統計，中國種植的轉Bt?棉面積就已經超過390?萬公頃，占棉花種植總面積的71.5?%。然而，隨著轉Bt?基因作物的應用和推廣，其在基因逃逸、改變土壤微生物生態結構、物種的耐藥性以及危害正常免疫系統等方面可能存在的潛在危害備受社會關注。“轉Bt基因玉米根際微生物和細菌生理群多樣性”（王敏等，生態學雜志，2010年03期）和“轉Bt基因玉米對土壤細菌數量多樣性的影響”（劉玲等，生態與農村環境學報，2011年03期）分別對室內、室外種植轉Bt玉米的土壤進行了細菌數量和多樣性分析，結果都發現種植轉Bt玉米的與空白對照組相比出現顯著差異。

“Cry1Ac?protoxin?from?Bacillus?thuringiensis?sp.kurstaki?HD73?binds?to?surface?proteins?in?the?mouse?small?intestine”（Vázquez-Padrón等，Biochem?Biophys?Res?Commun，2000年01期）在動物試驗發現，當小鼠攝取的Bt內、外毒蛋白達到10?mg/kg和100?mg/kg時，小鼠的T細胞ANAE陽性率、脾臟指數及巨噬細胞的吞噬功能均出現了明顯的抑制反應，隨著攝取劑量的增加，這種抑制作用越發明顯。試驗還發現，當Bt毒素蛋白在動物體內的蓄積系數大于6.24時，可以導致肝臟、腎臟及胃腸道等損傷，在肝臟和腎臟中可以觀察到細胞腫脹和空泡樣變性異象，并且能看見腎小球血管上皮細胞的病變，當然這也不能排除是由免疫反應造成的。長期大劑量使用Bt毒素蛋白，還會導致動物白細胞總數和血紅蛋白含量顯著性下降，這也說明Bt毒素蛋白具有明顯的免疫抑制毒性。開拓具有Bt毒素生物活性的替代生物效應物（例如：抗獨特型抗體）是開發生物農藥領域研究的熱點。

人源化的抗體基因因其來源于人類，具有與人類免疫系統基因同源的優勢，可以避免在其制劑噴灑或轉基因表達后在食品中的殘留而對人體免疫系統造成危害。

1974年，丹麥免疫學家Jerne在其“免疫網絡學說(Immune?Network?Theory)”中首次提出抗獨特型抗體的概念?？躬毺匦涂贵w(Anti-idiotype?antibody，以下簡稱Anti-Id)是指針對位于抗體分子可變區的獨特型(Idiotype，Id)產生的特異性抗體。Bona等根據Id與Anti-Id的血清學反應以及AId的功能，將抗獨特型抗體分為4種類型(α，β，γ和ε)。β型抗獨特型抗體由于具有“內影像”作用，即具有與(半)抗原相同的抗原決定簇，因而可以具有抗原的功能和生物活性。

目前普遍認為采用噬菌體展示技術，通過構建噬菌體抗體庫，經特異性篩選，可以獲得具有靶標抗原類似效應的抗獨特型抗體。采用噬菌體展示技術篩選特異性抗體的過程稱為“淘選(Panning)”，主要包括結合、洗滌、洗脫和擴增4個步驟。Raats等采用抗皮質醇單克隆抗包被做為固相抗原直接進行篩選，在進行篩選之前，用相同種屬的陰性單克隆抗體進行負篩選以避免篩選到與抗體恒定區結合的重組抗體片段，最終成功篩選到針對皮質醇的Anti-Id。Goletz等同樣利用噬菌體抗體展示系統并研究比較了不同洗脫方法對抗獨特型抗體片段篩選結果的影響，最終篩選到的96個克隆中有28個為具有抗獨特型特性的陽性克隆。目前針對可替代Bt活性效應物，特別是抗Bt毒素類型的抗獨特型單鏈抗體（以下簡稱Anti-Id?ScFvs）等相關材料及產品還未見報道。

發明內容

??針對目前轉Bt毒素作物及其毒素制劑的廣泛應用存在的安全隱患及超敏反應等問題，開拓具有Bt毒素生物活性的可替代生物效應物及其在生物防治害蟲中的應用，本發明是這樣實現的：