[發明專利]用于檢測結核分枝桿菌mRNA的引物和探針及其應用

有效

• 申請號: 201410036985.3
• 申請日: 2014-01-24
• 公開（公告）號: CN103773872A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 董瑞玲;朱玉蘭;王佃鵬;劉勝牙;李微;葉健忠;張樹平
• 申請（專利權）人: 深圳國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于病原體檢測領域，涉及一種用于檢測結核分枝桿菌的引物和探針及其應用。

背景技術

結核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，2010年新修訂的《中華人民共和國國境衛生檢疫法實施細則》中，明確規定衛生檢疫機關應當阻止患有傳染性肺結核病的外國人入境，而準確檢測到具有傳染性的結核分枝桿菌活菌是國境口岸攔截傳染性肺結核的關鍵。靈敏度高，特異性強、檢測時間短的PCR檢測技術在防控結核工作中起著越來越重要的作用。針對結核分枝桿菌DNA和16S?rRNA進行檢測的PCR方法不能判斷細菌在體內的活性，往往出現PCR擴增陽性而培養陰性的情況（陸宇，朱莉貞，段連山，等.mRNA作為結核分支桿菌活菌檢測標志的可行性研究[J].中華結核和呼吸雜志,2003,26(7):419-423.）。

結核分枝桿菌信使RNA（mRNA），由于半衰期很短，僅存在于活的、有代謝活性的菌體中，因此是活動性結核的重要標志（Hellyer?T?J,Desjardin?L?E,Teixeira?L,et?al.Detection?of?viable?Mycobacterium?tuberculosis?by?reverse?transcriptase-strand?displacement?amplification?of?mRNA[J].J?Clin?Microbiol,1999,37(3):518-523.Desjardin?L?E,Perkins?M?D,Wolski?K,et?al.Measurement?of?sputum?Mycobacterium?tuberculosis?messenger?RNA?as?a?surrogate?for?response?to?chemotherapy[J].Am?J?Respir?Crit?Care?Med,1999,160(1):203-210.）。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測結核分枝桿菌的引物和探針及其應用。

本發明所提供的用于檢測或輔助檢測結核分枝桿菌的組合物，由一個引物對和一個探針組成的組合物；所述引物對由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。

其中，序列1有19個核苷酸組成；序列2由18個核苷酸組成；序列3由22個核苷酸組成。

所述組合物中，組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子，以及所述探針，三者使用時的摩爾比為1:1:4；

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光報告基團連接在探針的5’末端，熒光淬滅基團連接在探針的3’末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光報告基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

所述熒光報告基團可為Joe(JOE)、Fam（FAM）、Hex(HEX)、Tet(TET)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3(CY3)或Cy5(CY5)。所述熒光淬滅基團可為Bhq1(BHQ1)、Tamra（TAMRA）、Rox(ROX)、Dabcy(DABCY)或Bhq2(BHQ2)。在本發明中，所述探針5’端標記的熒光報告基團具體為JOE，3’端標記的淬滅熒光基團具體為BHQ1。

檢測或輔助檢測結核分枝桿菌的引物對或探針也屬于本發明的保護范圍。

所述引物對具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。所述探針可為TaqMan熒光探針，其核苷酸序列具體為序列表中序列3。在本發明中，所述探針5’端標記的熒光報告基團具體為JOE，3’端標記的熒光淬滅基團具體為BHQ1。

所述引物對中，所述兩條單鏈DNA分子使用時的摩爾比為1:1。

上述組合物或引物對或探針在制備用于檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有結核分枝桿菌的試劑盒中的應用也屬于本發明的保護范圍。

含有上述組合物或引物對或探針的試劑盒也屬于本發明的保護范圍。

進一步，所述試劑盒中還可含有反轉錄酶和/或DNA聚合酶。