[發明專利]一種產慶大霉素A工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201410035981.3
• 申請日: 2014-01-26
• 公開（公告）號: CN103805544A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 洪文榮;陳洲琴;肖劍萍
• 申請（專利權）人: 福州大學;福州市鼓樓區榮德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/74;C12P19/50;C12R1/31
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于抗生素制藥領域，涉及一種產慶大霉素A工程菌及其應用。?

背景技術

小單孢菌可產生豐富的次級代謝產物，特別是氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素、西索米星和福提米星等。這些小單孢菌分布奇特，生長緩慢且細胞壁結構特殊，故研究進展緩慢。此外，由于缺乏通用的基因操作系統，小單孢菌遺傳操作困難，使得對其分子生物學的研究也大大落后于鏈霉菌。?

慶大霉素(Gentamicin，GM)是由小單孢菌屬中的絳紅小單孢菌(Micromonospora?purpurea)或棘孢小單孢菌（Micromonospora?echinospora）等發酵產生的氨基糖苷類廣譜抗生素，對多種革蘭陰性菌和陽性菌有較強的抗菌作用。1963年，美國人Weinstein首次發現，1969年被用于臨床，它是我國乃至世界抗感染必備的基本藥物。慶大霉素屬多組分代謝產物，臨床應用的慶大霉素為慶大霉素C族的混合物，主要為C1、C2、C1a和C2a；此外，作為慶大霉素中間體的A，B和X族等，也有非常重要的作用。慶大霉素A，X具有良好的抗原蟲和抗線蟲作用，G418常用于分子生物學試驗中的抗性篩選，慶大霉素B是進一步合成廣譜低毒氨基糖苷類抗生素異帕米星的母體藥物。目前氨基糖苷類抗生素已發展到了第三代，隨著此類抗生素作用機制研究的不斷深入和各種新興技術的不斷運用，各國科學家正通過各種化學改造，以獲得廣譜、低毒、高效、耐酶或抗耐藥菌的新衍生物。近年來，又發現氨基糖苷類抗生素具有抗HIV的功效，有望進一步開發出新型的專一性靶向RNA的類慶大霉素藥物。因此對該類稀有藥用微生物進行深入研究，特別是分子遺傳學方面的研究具有重要科學意義。?

盡管人們對小單孢菌和慶大霉素的研究已超過五十年，也取得了一些可喜的成果，但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究開發過程中，效價提高近萬倍，而慶大霉素五十年中僅提高幾十倍，兩者差距懸殊。二十世紀八十年代興起的鏈霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、產量提高、組分改善及雜合抗生素生產等方面取得了一定的進步，但在小單孢菌中的應用開發進展緩慢。2006年Piepersberg.W等公布了棘孢小單孢菌慶大霉素生物合成基因簇，長達84222bp。2012年潘成奇等公布絳紅色小單胞菌慶大霉素生物合成基因簇（44181bp，JQ975418）。嚴凌斌等于2011年成功建立大腸桿菌-小單孢菌結合轉移技術體系，為小單胞菌基因功能研究以及定向改造慶大霉素代謝流奠定了基礎。?

當慶大霉素生物合成進入X2到G-418的時候，涉及到兩次在非活性C上的甲基轉移反應（Scheme?1）。借助計算機分析慶大霉素生物合成基因簇，結果顯示：基因gntK產物介導了其中的一個C-甲基化反應。在磷霉素的生物合成中，Fom3是GntK-樣蛋白中有代表性的一員，因此提出：Fom3是一種C-甲基轉移酶，其底物為S-腺苷甲硫氨酸衍生的5^/-去氧腺苷基，并以甲基鈷胺素作為催化劑，催化非活性C上的C-H鍵，使該鍵發生均裂，Fom3同時也是甲基的一個來源。提出這種新型的甲基轉移機制是受Fom3結構域的構成所啟發（也就是，一個鈷胺素結合結構域和一個以Cys-XXX-Cys-XX-Cys基序為特征的S-腺苷甲硫氨酸基結構域），這種結構域的形式在Gntk中也存在。Gntk也和Fms7有高度同源性(Fok7在基因庫的登記號為AJ628421)，能在福提霉素KL1的C-6^/位上加上一個甲基。慶大霉素和福提霉素化學上的一個共同點是C-6^/位上的甲基化，而存在這種共同的化學作用支持了GntK催化C-6^/位上的甲基化反應這個觀點。盡管GntE序列與GntK序列的同源相似性極其有限，但GntE結構域的構成同樣與GntK類似。目前的研究表明：gntE的失活導致慶大霉素A2的積累，這表明gntE參與慶大霉素A2到A的轉變。此外，慶大霉素高產菌株被成功設計為積累慶大霉素A2。?