[發明專利]HPV18的重組腺相關病毒疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 201410035933.4
• 申請日: 2014-01-25
• 公開（公告）號: CN104140980A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 周玉柏;曾毅;劉海庭;方軍;沈思嗣;李勁濤;李澤琳
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;A61K48/00;A61K39/12;A61P31/20;A61P35/00
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域。本發明涉及一種含密碼子優化型HPV18L1基因的2/1型重組腺相關病毒疫苗及其制備方法。

背景技術

人乳頭瘤病毒（Human?papillomavirus,HPV）是一種在自然界廣泛存在的嗜上皮性病毒，屬于乳多空病毒科的乳頭瘤病毒屬的無包膜閉環雙鏈DNA病毒。20世紀70年代，Zur?Hausen提出HPV是宮頸癌的病毒學成因，之后國內外學者就兩者之間的關系進行了大量研究并提出90%以上的宮頸癌是由于HPV感染引起，國際癌癥研究協會(IARC)發表的研究顯示超過2/3的子宮頸癌病例與HPV16型(51％)或HPV18型(16.2％)感染有關。

1982年syrjane的研究表明HPV和食管鱗癌之間存在相關性，之后的不少研究也證實了這一觀點（Shen?ZY，Xu?LY，Li?EM，et?al.The?multistage?process?ofcarcinogenesis?in?human?esophageal?epithelial?cells?induced?byhuman?papillomavirus.Oncol?Rep，2004，11：647-54.）其中曲鵬，李勁濤的研究也表明HPV感染可能是食管鱗癌的病毒學誘因，結果顯示標本HPV感染率為82.6％，其中HPV16型感染率34.8％，HPV18型感染率34.8。（安陽地區不同食管鱗癌標本HPV感染率的比較研究，曲鵬，李勁濤）。

全球范圍內子宮頸癌是第二大常見的婦科惡性腫瘤，每年約有50萬新增子宮頸癌病例，28萬的死亡病例，我國每年新增宮頸癌病例約13.5萬，占全球發病數量的l／3，約8萬人死亡。

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發病率和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發地區之一，每年平均病死約15萬人。男多于女，發病年齡多在40歲以上。

根據HPV與良性和惡性腫瘤的相關度，將HPV病毒分為低危型和高危型兩種。其中低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81等，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59等。HPV基因組L區的L1作為HPV的主要衣殼蛋白能夠單獨或與次要衣殼蛋白L2共同在體外自行組裝成VLPs。已經上市并廣為接種的兩種針對HPV預防性疫苗，Merck公司的HPV6、11、16、18四價VLP?Gardasil疫苗和GSK公司研制的HPV16、18雙價VLP?Cervarix疫苗，都是由HPV?L1蛋白組裝成的VLPs。其作用機理是以VLP三作為靶抗原誘導機體產生特異性中和抗體達到預防相應型別HPV的感染。

AAV屬細小病毒科,為一缺陷病毒,是正鏈或負鏈單鏈DNA病毒,外包二十面體衣殼蛋白,病毒顆粒的直徑在20～26nm之間。AAV的復制依賴于輔助病毒(helper?virus)，如腺病毒或皰疹病毒。野生型AAV2(wtAAV2)基因組為線性單鏈DNA，大小約4.7kb。兩末端各含一個倒置末端重復序列(inverted?terminal?repeat，ITR)，中間含有rep和cap基因。Xiao等（1998）將腺病毒上起輔助功能的基因全部構建到一個新的質粒上，由質粒代替腺病毒向rAAV2提供輔助功能，從而構建了重組II型AAV載體（rAAV2），它具有長時程有效表達外源基因、無致病性、免疫原性弱和基因定點整合等多項優點。重組2/1型AAV(rAAV2/1)是近年來出現的新型載體,采用AAV2的ITR,而僅將AAV2的外殼蛋白基因置換成AAV1的外殼蛋白基因，它在保持II型AAV載體高效表達外源基因、高安全性等優點的同時提供了更好的肌纖維細胞嗜性，是目前基因治療領域中倍受矚目的載體之一。

HPV18L1基因相對E6，E7癌基因而言更安全，且L1編碼的蛋白能誘導產生較高的體液免疫和細胞免疫效果，而2/1型重組腺相關病毒（rAAV2/1）也具有長時程有效表達外源基因、無致病性等有點，因此可以開發制備防治食管癌和宮頸癌的基于HPV18L1的重組腺相關病毒疫苗。

發明內容

本發明提供了一種密碼子優化型的編碼HPV18主要衣殼蛋白L1的基因序列以及一種含有上述優化型基因的2/1型重組腺相關病毒（rAAV2/1）。

一種制備所述2/1型重組腺相關病毒（rAAV2/1）的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列克隆到重組腺相關病毒穿梭質粒中，得到重組腺相關病毒穿梭質粒；