[發(fā)明專利]熒光假單胞菌CB113 QS系統(tǒng)comQ基因缺失突變菌株及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410035661.8
• 申請日: 2014-01-25
• 公開（公告）號: CN103805550A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張祥輝;王璐;潘洪玉;趙玉海;王秀明
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A01N63/00;A01P3/00;C12R1/39
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責(zé)任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株熒光假單胞菌，特別涉及comQ基因缺失的熒光假單胞菌突變菌株，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

細(xì)菌的群體感應(yīng)（quorum?sensing,QS），是細(xì)菌根據(jù)種群密度大小進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間相互交流、協(xié)調(diào)群體行為的一種重要機制。雖然每種革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的群體感應(yīng)機制不同，但其調(diào)控蛋白具有高度同源性，目前研究的大多數(shù)革蘭氏陰性菌都存在相似的QS系統(tǒng)。在Pseudomonas?fluorescens中，comX-comQ-comP-comA是QS系統(tǒng)中主要的信號途徑，調(diào)控細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的形成、芽孢的產(chǎn)生、生物膜的形成以及抗生素的產(chǎn)生等。comX基因編碼55氨基酸的comX信息素前體，comQ負(fù)責(zé)將沒有活性的信號分子comX轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘男盘柗肿樱瑸?0氨基多肽（ADPITRQWGD）。信號分子comX被分泌到胞外并在胞外積累，當(dāng)胞外介質(zhì)中的信號分子達(dá)到一定濃度時可激發(fā)細(xì)胞膜受體蛋白組氨酸激酶comP的活性，comP自磷酸化并將自身攜帶的-P轉(zhuǎn)移到調(diào)控因子comA上，磷酸化的comA具有了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的活性并調(diào)控下游一系列基因的表達(dá)，可見comQ對整個QS系統(tǒng)的啟動具有重要的功能。基于該基因在細(xì)菌中的重要地位，發(fā)明人研究了熒光假單胞菌中comQ基因的作用，出乎意料的發(fā)現(xiàn)，突變后的熒光假單胞菌對真菌有更強的抑制作用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一株comQ基因缺失的熒光假單胞菌突變菌株。?

一株熒光假單胞菌突變菌株M2由熒光假單胞菌CB113中的comQ基因編碼區(qū)675bp缺失獲得。?

一種突變菌株M2的應(yīng)用，在于與野生型菌株相比顯著提高對病原真菌的抑制活性,所述病原真菌為玉米大斑病菌和人參銹腐病菌。?

本發(fā)明實現(xiàn)過程如下:?

CB113是從長白山土壤中分離純化得到，首先在PDA上進(jìn)行分離初篩，然后進(jìn)行拮抗效果鑒定，并采用牛津杯擴散實驗進(jìn)行復(fù)篩，確定了CB113對多種菌株具有很好的拮抗能力。通過對該菌進(jìn)行形態(tài)特征和培養(yǎng)特征觀察，生理生化的鑒定以及16SrDNA的序列分析，初步鑒定該菌株為熒光假單胞菌，命名為Pseudomonas?fluorescens?CB113。相關(guān)的研究結(jié)果已經(jīng)以碩士論文的形式收錄在中國期刊網(wǎng)中，碩士論文題目為“玉米大斑病菌拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件的研究”，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以隨意獲得該菌株，而且申請人可以隨時提供給需要該菌株的科研機構(gòu)或院所。?

根據(jù)已公布的與CB113菌株近緣的細(xì)菌中的comQ保守序列設(shè)計兩對引物Q-L-F/Q-L-R?和Q-R-F/Q-R-R，以CB113基因組DNA為模板，利用設(shè)計的引物，通過PCR方法獲得產(chǎn)物Q-L、Q-R，大小分別為1268bp和1432bp。引物序列如表1所示：?

表1本試驗使用的PCR引物Table1PCRprimers?used?in?this?study?

在基因組中的上、下游片段。Q-L、Q-R經(jīng)HindIII酶切連接后，以連接產(chǎn)物為模板，利用Q-L-F/Q-R-R進(jìn)行PCR擴增，獲得大小約2.7kb的DNA片段，與comQ基因相比，其內(nèi)部缺失大小約600bp，片段經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后，插入同樣雙酶切的pMAD質(zhì)粒相應(yīng)位點，構(gòu)建了pMAD-ΔcomQ缺失突變載體，利用電擊轉(zhuǎn)化的方法將pMAD-ΔcomQ轉(zhuǎn)入CB113野生型菌株，得到轉(zhuǎn)化子，經(jīng)高溫誘導(dǎo)，使pMAD-ΔcomQ與CB113菌株的comQ基因上下游基因序列發(fā)生兩次同源重組，獲得CB113菌株comQ基因缺失突變菌株。?

以Q-L-F/Q-R-R為引物對篩選到的突變體菌株進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果證明，突變體菌株中的擴增片段比CB113野生型菌株中擴增的條帶小約600bp，進(jìn)一步將從突變體菌株中獲得的擴增片段進(jìn)行測序，結(jié)果證明，同野生型comQ基因相比，突變體菌株中ΔcomQ中間缺少了675個堿基，將該突變體菌株為M2。?

本發(fā)明的有益效果在于首次獲得了一株comQ基因缺失的熒光假單胞突變菌株，該菌株具有較好的抑制真菌的特性，為現(xiàn)有技術(shù)提供了一種更好的抑制真菌的途徑。?

附圖說明

圖1為熒光假單胞菌中comX-comQ-comP-comA群體感應(yīng)系統(tǒng)信號途徑示意圖?

圖2為Q-L、Q-R的PCR擴增片段的電泳圖譜：DNA?marker;2.Q-L;3.Q-R?

圖3為PCR擴增片段的電泳圖譜：1.ΔcomQ;M:DNA?marker?