[發明專利]一種新型替代內源基因表達的慢病毒載體及其構建方法

在審

• 申請號: 201410034811.3
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN104805119A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 陳齊;劉軍;謝丹
• 申請（專利權）人: 杭州紐貝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種新型替代內源基因表達的慢病毒載體，其特征是：這種慢病毒載體具有以下結構：在慢病毒5’和3’LTR中間插入U6啟動子用于轉錄一段shRNA序列，shRNA插入區含有BamHI和XhoI雙酶切位點，可插入退火后的shRNA序列；EF1a啟動子轉錄表達Flag標簽融合的外源基因，Flag標簽融合在外源基因的N端，多克隆位點含有HpaI、EcoRI和NheI3種酶切位點用于插入外源基因，其中HpaI為平末端酶切，保證任何基因都可以插入；IRES用于啟動表達EGFP報告基因；實現一條由EF1a轉錄的RNA可以產生兩個蛋白，即過表達外源蛋白和EGFP。

2.根據權利要求1所述的慢病毒載體的構建方法，其步驟是：

1)pUC-EF1a-IRES-EGFP載體的構建：對EF1a-IRES-EGFP元件進行克隆，將克隆得到的EF1a-IRES-EGFP用EcoRI和PstI雙酶切，選擇pUC18作為原始質粒，用EcoRI和PstI雙酶切，將回收得到的質粒和酶切好的EF1a-IRES-EGFP元件進行連接；

2)pLL3.7-CQ載體的構建：設計合成正反向引物ENZYf1，其序列為5’-TGGATCCGCGCGGTGACC-3’，和ENZYr1，其序列為5’-TCGAGGGTCACCGCGCGGATCCA-3’，用于形成shRNA插入位點，正反向雙鏈的退火，選擇慢病毒載體pLL3.7作為原始質粒，用HpaI和XhoI雙酶切，退火產物和酶切好的載體連接；

3)pUC-Flag-EGFP載體的構建：設計合成正反向引物FlagF(5’-GATCAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGTTAACGAATTCG-3’)和FlagR(5’-CTAGCGAATTCGTTAACCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGCT-3’)用于形成帶有Flag標簽的多克隆位點，正反向雙鏈的退火，選擇pUC-EF1a-IRES-EGFP作為原始質粒，用BamHI和NheI雙酶切，退火產物和酶切好的載體連接；

4)pLenti-FlagN-shRNA載體的構建：對EF1a-Flag-EGFP元件進行克隆，前面PCR克隆得到的EF1a-Flag-EGFP元件用Nsil酶切，選擇慢病毒載體pLL3.7-CQ作為原始質粒，用NsiI和PvuII雙酶切，將回收得到的質粒和酶切好的EF1a-Flag-EGFP元件進行連接，最終獲得插入序列和方向均正確的載體即pLenti-FlagN-shRNA。