[發(fā)明專利]一種馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410034605.2
• 申請(qǐng)日: 2014-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN103757138A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁銘;盧訓(xùn);張仲凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 昆明知道專利事務(wù)所(特殊普通合伙企業(yè)) 53116
• 代理人: 姜開俠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病毒學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

馬鈴薯病毒病田間表現(xiàn)癥狀復(fù)雜多樣，常見的癥狀類型可歸納如下：(1)花葉型。葉面出現(xiàn)淡綠、黃綠和濃綠相間的斑駁花葉（有輕花葉、重花葉、皺縮花葉和黃斑花葉之分），葉片基本不變小，或葉片變小、皺縮，植株矮化。(2)卷葉型。葉緣向上卷曲，甚至呈圓筒狀，色淡，變硬革質(zhì)化，有時(shí)葉背出現(xiàn)紫紅色。(3)壞死型（或稱條斑型）。葉脈、葉柄、莖枝出現(xiàn)褐色壞死斑或連合成條斑，甚至葉片萎垂、枯死或脫落。(4)叢枝及束頂型。分枝纖細(xì)而多，縮節(jié)叢生或束頂，葉小花少，明顯矮縮。常見的馬鈴薯病毒病有3種類型。花葉型：葉面葉綠素分布不均，呈濃綠淡綠相間或黃綠相間斑駁花葉，嚴(yán)重時(shí)葉片皺縮，全株矮化，有時(shí)伴有葉脈透明；壞死型：葉、葉脈、葉柄及枝條、莖部都可出現(xiàn)褐色壞死斑，病斑發(fā)展連接成壞死條斑，嚴(yán)重時(shí)全葉枯死或?萎蔫脫落；卷葉型：葉片沿主脈或自邊緣向內(nèi)翻轉(zhuǎn)，變硬、革質(zhì)化，嚴(yán)重時(shí)每張小葉呈筒狀。?此外還有復(fù)合侵染，引致馬鈴薯發(fā)生條斑壞死。輕花葉病：由X病毒引起，并常與其他病毒負(fù)荷侵染。病株生育正常，僅葉片表現(xiàn)出不同的斑駁或輕微花葉，氣溫過高、過低時(shí)癥狀都易隱蔽。病毒由汁液接觸傳染。重花葉病：病株上的葉脈、葉柄及莖均有黑褐色壞死條斑，并發(fā)脆易折。感病初期葉片呈現(xiàn)斑駁花葉或有枯斑，以后背面葉脈壞死，甚至沿葉柄蔓延至主莖。主莖發(fā)病時(shí)產(chǎn)生褐色條斑，導(dǎo)致全葉萎蔫，但不脫落。重花葉病由Y病毒侵染引起。Y病毒既可以通過汁液機(jī)械傳染，又可以通過蚜蟲傳染。Y病毒與X病毒混合侵染時(shí)呈現(xiàn)嚴(yán)重的皺縮花葉及矮化癥。我國發(fā)生的馬鈴薯退化，主要由這兩種病毒復(fù)合侵染所致。馬鈴薯卷葉病：病株葉片邊緣以主脈為中心向上卷曲，革質(zhì)化，葉色變淡，有的略呈紫紅色。有的病株塊莖切面呈網(wǎng)狀壞死斑。病薯產(chǎn)生的重病株，植株短化，老葉卷成筒狀。本病由馬鈴薯卷葉病毒引起，在自然條件下由蚜蟲傳染。病原為：馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒。

馬鈴薯X病毒?(Potato?virus?X?簡稱PVX)在馬鈴薯上引起輕花葉癥，有時(shí)產(chǎn)生斑駁或環(huán)斑，病毒粒體線形，長480~580納米，其寄主范圍廣，系統(tǒng)侵染的植物主要是茄科，病毒稀釋限點(diǎn)100000~1000000倍，鈍化溫度68~75℃，體外存活期l年以上。

馬鈴薯S病毒?(Potato?virus?S?簡稱PVS)，在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥，病毒粒體線形，長650納米，其寄主范圍較窄，系統(tǒng)侵染的植物僅限于茄科的少數(shù)植物，病汁液稀釋限點(diǎn)1~10倍，鈍化溫度55~60℃，體外存活期3~4天。

馬鈴薯A病毒?(Potato?virus?A簡稱PVA)在馬鈴薯上引起輕花葉或不顯癥病毒粒體線形，長730納米，其寄主范圍較窄，僅侵染茄科少數(shù)植物，病汁液稀釋限點(diǎn)10倍，鈍化溫度44~52℃，體外存活期12~18小時(shí)。

馬鈴薯Y病毒?(potato?virus?Y?簡稱PVY)，在馬鈴薯上引起嚴(yán)重花葉或壞死斑和壞死條斑，病毒粒體線形，長730納米，該病毒寄主范圍較廣，可侵染茄科多種植物，病汁液稀釋限點(diǎn)100~1000倍，鈍化溫度52~62℃，體外存活期1~2天。

馬鈴薯卷葉病毒?(Potato?leafroll?virus簡稱PLRV)病毒粒體球狀，直徑25納米。該病毒寄主范圍主要是茄科植物，在馬鈴薯上引起卷葉癥，病毒稀釋限點(diǎn)10000倍，鈍化溫度70℃，體外存活期12~24小時(shí)，ZC低溫下存活4天。此外TMV也可侵染馬鈴薯。

在馬鈴薯生長中，馬鈴薯病毒病發(fā)生危害普遍且嚴(yán)重影響了馬鈴薯產(chǎn)質(zhì)量，主要病原為馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒，但田間對(duì)這類病毒病病原難以通過癥狀區(qū)分，因此無法制定有效的病害預(yù)防措施；在研究病害侵染循環(huán)和病害發(fā)生早期，利用血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)靈敏度不能較好地確定不同病毒的侵染情況，因此，需要建立一種可以大量、快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)不同時(shí)期病樣以及田間周邊環(huán)境中病毒傳播介體、中間寄主等進(jìn)行檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種馬鈴薯病毒的快速靈敏檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括前處理、PCR反應(yīng)、電泳檢測(cè)步驟，具體包括：