[發(fā)明專利]麥長(zhǎng)管蚜特異性SS-COI引物對(duì)、試劑盒及其檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410033243.5
• 申請(qǐng)日: 2014-01-23
• 公開（公告）號(hào): CN103740841A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王倩;楊帆;陸宴輝;楊益眾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種麥長(zhǎng)管蚜特異性SS-COI引物對(duì)、試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

麥長(zhǎng)管蚜Macrosiphum?avenae(Fabricius)，屬同翅目，蚜科。分布在中國各產(chǎn)麥區(qū)。寄主于小麥、大麥、燕麥，南方偶害水稻、玉米、甘蔗、獲草等。前期集中在葉正面或背面，后期集中在穗上刺吸汁液，致受害株生長(zhǎng)緩慢，分蘗減少，千粒重下降，是麥類作物重要害蟲。也是麥蚜中的優(yōu)勢(shì)種。麥長(zhǎng)管蚜在田間有多種捕食性天敵（如瓢蟲、草蛉、蜘蛛等），天敵的保護(hù)和利用是麥長(zhǎng)管蚜防治的重要措施。如何對(duì)田間不同種類天敵的控制作用進(jìn)行合理評(píng)估，進(jìn)而選擇出繁殖力高、捕食能力和尋找寄主能力強(qiáng)、控害作用明顯的天敵資源，是進(jìn)行天敵保護(hù)合理保護(hù)與利用的基礎(chǔ)與核心。

Species-Specific-COI?PCR檢測(cè)技術(shù)是在mtDNA?COI技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測(cè)結(jié)果，無需測(cè)序和序列比對(duì)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)天敵對(duì)獵物的捕食作用開辟了新途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一對(duì)能特異性鑒別麥長(zhǎng)管蚜的PCR引物，包括正向引物：5′-TTGGATCATCACTTAGAATTC-3′（如SEQ?ID?NO.1所示）和反向引物：5′-TATTATTAATGATGGTGGTAATAG-3′（如SEQ?ID?NO.2所示）。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)麥長(zhǎng)管蚜的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)試劑和上述引物對(duì)，優(yōu)選的試劑盒，還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種麥長(zhǎng)管蚜的特異性檢測(cè)方法，包括使用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟，如出現(xiàn)258bp擴(kuò)增條帶，如SEQ?ID?NO.3所示，則判定為麥長(zhǎng)管蚜的樣本。

優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的步驟中PCR反應(yīng)體系以20μl計(jì)為：

優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的步驟中，PCR反應(yīng)條件為：94℃4分鐘；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，共45個(gè)循環(huán)；72℃1秒。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種試劑盒在檢測(cè)麥長(zhǎng)管蚜中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一對(duì)特異性引物，特異性強(qiáng)，只對(duì)麥長(zhǎng)管蚜具有擴(kuò)增能力，而對(duì)我國華北棉區(qū)內(nèi)棉田中的主要昆蟲無擴(kuò)增產(chǎn)物。采用本發(fā)明提供的方法和引物檢測(cè)麥長(zhǎng)管蚜，準(zhǔn)確性高，可擴(kuò)增出258bp的片段。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速、高效，一般可在5個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)的研究捕食性天敵對(duì)害蟲捕食效應(yīng)的觀察法和生化手段研究捕食者與獵物關(guān)系的程序的復(fù)雜性、費(fèi)用高、缺乏對(duì)靶標(biāo)的特異性等問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中麥長(zhǎng)管蚜特異性引物L(fēng)FMaF/LFMaR的PCR檢測(cè)結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp?ladder；1-114為表1中序號(hào)所對(duì)應(yīng)昆蟲的擴(kuò)增結(jié)果，-為陰性對(duì)照。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中麥長(zhǎng)管蚜特異性引物L(fēng)FMaF/LFMaR的DNA濃度梯度檢測(cè)結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp?ladder；1-7為模板DNA濃度192.8ng/μL依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對(duì)照。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中麥長(zhǎng)管蚜特異性引物L(fēng)FMaF/LFMaR的質(zhì)粒濃度梯度檢測(cè)結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp?ladder；1-10為模板質(zhì)粒濃度4.96E+10依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook?J&Russell?DW,Molecular?cloning:a?laboratory?manual,2001），或按照制造廠商說明書建議的條件。

實(shí)施例1?引物L(fēng)FMaF/LFMaR對(duì)麥長(zhǎng)管蚜的擴(kuò)增效果

1）麥長(zhǎng)管蚜基因組的制備

將單頭蚜蟲放入1.5ml離心管中將其磨碎，用TIANamp?Genomic?DNA?Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（天根生物有限公司，北京）提取單頭蚜蟲基因組。將DNA溶液儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆茫M(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)吸取1μL溶液作為DNA模板。

2）合成檢測(cè)麥長(zhǎng)管蚜的特異性SS-COI引物