[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)半胱氨酸的試劑和方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410033092.3
• 申請(qǐng)日: 2014-01-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103788076A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陰彩霞;霍方俊;楊瑜濤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山西大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07D405/04
• 分類(lèi)號(hào): C07D405/04;G01N21/64
• 代理公司: 山西五維專(zhuān)利事務(wù)所(有限公司) 14105
• 代理人: 張福增

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及半胱氨酸檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種試劑及其合成方法，以及這種試劑在檢測(cè)半胱氨酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

L-半胱氨酸（L-Cys）是20種天然氨基酸中唯一具有還原性基團(tuán)巰基（-SH）的氨基酸，它在生物體內(nèi)參與細(xì)胞的還原過(guò)程及蛋白質(zhì)、谷胱甘肽的合成。半胱氨酸在醫(yī)藥、食品添加劑及化妝品領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用，它可以用于一些抗生素以及治療皮膚損傷，增強(qiáng)生物體的抗病能力，具有重要的生物化學(xué)研究?jī)r(jià)值。此外，它也可以作為抗輻射劑及抗氧化劑。目前，關(guān)于L-Cys的分析方法主要有高效液相色譜法（潘峰，孫瑋，張青，等.高效液相色譜法測(cè)定血漿中同型半胱氨酸[J].氨基酸和生物資源，2010，32（4）：55-57.）、光度法(陳亞紅，李占靈，張會(huì)霞.酶抑制動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定L-半胱氨酸[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（1）：38-41.；劉養(yǎng)清，韓素琴.亞硝酰鐵氰化鈉法測(cè)定復(fù)雜樣品中半胱氨酸含量的方法研究[J].山西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，14（2）：42-45.)、電化學(xué)方法(Mohammad?K.Amini，Jafar?H.Khorasani，Shokooh?S.Khaloo，et?al.Cobalt（II）salophen-modified?carbon-paste?electrode?for?potentiometric?and?voltammetric?determination?of?cysteine[J].Anal.Biochem，2003，320：32-38.；N.Maleki，A.Safavi，F(xiàn).Sedaghati，et?al.Efficient?electrocatalysis?of?L-cysteine?oxidation?at?carbon?ionic?liquid?electrode[J].Anal.Biochem，2007，369：149-153.)等。

在本發(fā)明中，合成了一種基于馬來(lái)酰亞胺的化合物，通過(guò)Cys和化合物在Michael加成反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)Cys的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種合成簡(jiǎn)單、操作方便、選擇性高、水溶性好的定量檢測(cè)Cys的試劑，以及該試劑在Cys檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的快速檢測(cè)Cys的試劑和方法，是基于一種馬來(lái)酰亞胺衍生物N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺（N-[4-Methylcoumarin-7-yl]maleimide），在pH為7.4的HEPES溶液中定量地檢測(cè)Cys的含量。該檢測(cè)方法，對(duì)Cys顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、靈敏、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

該試劑的結(jié)構(gòu)式：

該試劑的合成方法，步驟為：7-氨基-4-甲基香豆素和順丁烯二酸酐按摩爾比1︰1完全溶解在冰乙酸中，回流5小時(shí)，停止反應(yīng)；濃縮、冷卻后抽濾，并用碳酸鈉溶液洗滌，最后用苯重結(jié)晶得到土黃色固體。

用該試劑檢測(cè)Cys的方法，步驟為：

（1）、配制pH=7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，配制2mM的N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺的甲醇溶液；

（2）、按體積比20000:1，將HEPES緩沖溶液和N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺的甲醇溶液加到干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，隨著待測(cè)樣的加入,398nm的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；

（3）、把2mL的HEPES緩沖溶液、0.1μL的N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺甲醇溶液加到另一個(gè)熒光比色皿中，分別在加入Cys溶液的體積為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00μL時(shí)，在熒光分光光度儀上測(cè)定398nm對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度F為104、168、236、304、372、436、503、569，以Cys濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)熒光強(qiáng)度F－F₀為縱坐標(biāo)繪制圖，F(xiàn)₀﹦39，得到Cys濃度的工作曲線；線性回歸方程為：F－F₀=-1.61+264.9c，c的單位為μM；

（4）、將HEPES緩沖溶液2000uL和N-[4-甲基香豆素-7-基]馬來(lái)酰亞胺甲醇溶液0.1uL加到干凈的熒光比色皿中，用微量進(jìn)樣器吸取V?ul待測(cè)樣品溶液，加入到此干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測(cè)，將測(cè)得的熒光強(qiáng)度代入（3）的線性回歸方程，得到濃度c，待測(cè)樣品C_{待測(cè)樣}=2000uL×c×10^-6/VuL,即可求得Cys的濃度。