[發(fā)明專利]一種海帶重離子輻射誘變育種新方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410032427.X
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN103766214A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李曉捷;張立楠;王振華;羅世菊;張壯志;孫娟;梁廣津;趙楠;趙聚萍;韓新玉;鮑建成;李霞;曹增梅;曲艷艷
• 申請（專利權(quán)）人: 山東東方海洋科技股份有限公司
• 主分類號: A01H1/06
• 分類號: A01H1/06
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 鄭自群

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種海帶重離子輻射誘變育種新方法。

背景技術(shù)

海帶是我國養(yǎng)殖面積最廣、經(jīng)濟價值最大的大型海藻。我國海帶遺傳改良和育種工作在上世紀50年代末就已開展，并在配子體克隆細胞系構(gòu)建及其雜交育種技術(shù)方面取得突破，但由于我國本身并無海帶自然分布，可利用的種質(zhì)資源非常少，因此不同品種（系）間的性狀差異不明顯，品種改良效果仍然十分有限。輻射育種具有突變率高、育種周期短等優(yōu)勢，可以誘導(dǎo)出現(xiàn)大量的新基因源，極大地豐富育種工作中的原材料，從而較大幅度地改變經(jīng)濟性狀。目前還未見有涉及利用重離子輻射進行海藻育種的報道。海帶配子體克隆細胞系具有可長期保存、遺傳性一致和發(fā)育全能性的特點，是海帶種質(zhì)保存對象，以其為單位進行輻射誘變處理，結(jié)合海帶配子體克隆細胞雜交技術(shù)可獲得數(shù)量多、種類多的突變植株。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種海帶育種新方法，該方法是基于重離子輻射誘變海帶配子體細胞并從其后代中篩選優(yōu)良異植株。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種海帶重離子輻射育種方法，包括以下步驟：將海帶配子體克隆細胞系進行分散過濾至每個配子體細胞段由1-3個配子體細胞組成，用¹²C重離子輻射，用海帶配子體克隆育苗技術(shù)培育孢子體，待孢子體成熟后進行表型和品質(zhì)性狀測定，對正向變異幅度大的候選植株進行DNA變異檢測，將表型性狀和品質(zhì)性狀明顯改良并且DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變異的植株作為新品種選育的育種材料。

所述的海帶配子體克隆細胞進行分散是指將海帶配子體克隆細胞系用超聲波打碎，過濾。

所述的超聲波打碎的超聲條件為：設(shè)定功率為200W，超聲共6次，10s/次，間隔6s；所述的過濾是用400目篩絹過濾。

所述的¹²C重離子輻射的能量為80MeV，劑量為80Gy。

所述的海帶配子體克隆育苗技術(shù)培育孢子體是指將重離子輻射后的配子在溫度8-15℃，光照強度800-1200lux，光照周期為L:D=24h:0h條件下培養(yǎng)擴增后，將雌、雄配子體細胞按照2:1的比例混合后進行海帶配子體克隆育苗技術(shù)培育。

所述的正向變異幅度大的候選植株是指將經(jīng)過重離子輻射的植株與未經(jīng)輻射的配子體雜交獲得的植株在株長、株寬、株中寬度、株厚、株鮮重五個表型性狀及褐藻膠和甘露醇含量品質(zhì)性狀指標(biāo)的比較，取正向變異數(shù)據(jù)大于20%的植株為候選植株。

所述的DNA變異檢測可采用RAPD/ISSR/AFLP分子標(biāo)記擴增以及瓊脂糖凝膠電泳/聚丙烯凝膠電泳方法進行。

本發(fā)明的優(yōu)點在于通過重離子輻射誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生大量變異，能在較短的時間內(nèi)獲得優(yōu)良變異植株，保存與優(yōu)良性狀相關(guān)的新基因源。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.輻射材料

本實施例的實驗材料海帶配子體克隆細胞系019601016（雌）、019601001（雄）選自國家海藻工程技術(shù)研究中心海帶種質(zhì)庫中，這兩個克隆細胞系于1996年從“901”海帶品種中的一株海帶中分離培養(yǎng)得到。海帶配子體克隆細胞系的分離與培養(yǎng)方法為：將有孢子囊的成熟海帶經(jīng)過10℃煮沸消毒海水擦洗、1.5%KI浸泡10分鐘、陰干刺激后，進行游孢子放散和附著，培養(yǎng)條件為：溫度8-15℃，光照強度1500-2000lux，光照周期L:D=10h:14h；待游孢子發(fā)育成雌雄可辨的配子體后用微吸管分離獲得單個雌、雄配子體，將成功分離后的海帶配子體細胞培養(yǎng)在含營養(yǎng)鹽（P濃度10ppm，N濃度1ppm）的培養(yǎng)液中，放置于溫度8-15℃，光照強度800-1200lux，光照周期為L:D=24h:0h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在此條件下海帶配子體可進行營養(yǎng)生長，從而形成海帶配子體單克隆細胞系。

2.重離子輻射

將兩個海帶配子體克隆細胞系分別用超聲波（設(shè)定功率200W，共6次，10s/次，間隔6s）打碎，并用400目篩絹進行過濾，使濾液中的每個配子體細胞段由1-3個左右配子體細胞組成。將配子體細胞濾液分裝到0.2ml離心管中，放入離子束注入機靶室中進行輻射。以能量為80MeV，劑量為80Gy的12C重離子束對輻射材料進行輻照。將輻照后的雌、雄配子體細胞分別混合后，重新放置于培養(yǎng)箱中恢復(fù)擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度8-15℃，光照強度800-1200lux，光照周期為L:D=24h:0h。