[發明專利]在胞內環境中表現出增強的穩定性的免疫球蛋白構架及其鑒定方法

有效

• 申請號: 201410031953.4
• 申請日: 2003-05-21
• 公開（公告）號: CN103739706A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: K·緹索特;S·艾沃特;A·奧弗德爾茂爾;A·巴伯里斯;D·艾施爾
• 申請（專利權）人: 艾斯巴技術-諾華有限責任公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K19/00;C12N15/13;C12N15/62;C12N15/81;C12N15/85;C12N1/19;C12N5/10;C40B50/06;C40B40/02;G01N33/68;C12R1/865
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 林遠成

本申請是分案申請，其直接母案申請是申請號為201010575786.1、申請日為2003年5月21日的同名發明專利申請；其原始母案申請是申請號為03814626.6、申請日為2003年5月21日的同名發明專利申請。?

發明領域

本發明涉及蛋白質化學、分子生物學以及免疫學。?

相關技術領域背景?

抗體能以高度的特異性和親和力識別并靶向幾乎任何分子。這個特點已被開發，以便將這些天然蛋白轉變為用于診斷和治療應用的強有力的工具。重組DNA技術的進展已推動了抗體基因在廣泛種類的非淋巴細胞中的操作、克隆和表達(Skerra,1988;Martineau,1998;Verma,1998)。已經構建了許多不同的抗體片段，以便最佳地滿足各種應用。保留整個母體免疫球蛋白全部抗原結合能力的最小實體是單鏈Fv片段(scFv)(Bird,1988)。該抗體片段包含由柔性肽接頭連接起來的重鏈和輕鏈可變區，這使得該蛋白能夠由單個基因表達。?

抗體片段較之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的優勢。由于分子小，它們在多種表達宿主細胞如大腸桿菌細胞中的表達得以易化、且產量得以提高(Plückthun,1996)。而且，抗體片段允許在體內應用中改善腫瘤穿透力(Yokota,1992)，并且它們能夠與多種用于治療途徑的效應分子共價連接。?

天然存在的抗體是由漿細胞分泌的，已進化至能夠在胞外氧化環境中行使功能。為獲得其功能性折疊結構，它們通常需要在不同結構域內形成二硫鍵，這對于免疫球蛋白折疊是至關重要的。與全長抗體形成對照，scFv或Fab抗體片段原則上能夠在任何細胞內部的還原環境中功能性地表達，并定向到任何區室，以靶向胞內蛋白，從而引發?特定的生物學效應(Biocca,1991)。的確，有些稱之為內體（intrabodies）的胞內單鏈抗體片段，已被成功地用于調節不同的生物系統中胞內靶蛋白的功能。從而，針對病毒侵染的抗性已在植物生物技術中得到展示(Tavladoraki,1993;Benvenuto,1995)，內體與HIV蛋白的結合業已證明(Rondon,1997)，并且與癌基因產物的結合(Biocca,1993;Cochet,1998;Lener,2000)也已有描述。而且胞內抗體在表征目前通過人類基因組測序鑒定到的大量基因的功能方面有希望成為有價值的工具(Richardson,1995;Marasco,1997)。例如，它們可在功能基因組途徑中用于封閉或調節新近鑒定的蛋白的活性，由此促成對其功能的了解。最后，內體具有診斷和治療應用的潛力，例如在基因治療環境中。?

盡管存在極大的前景，功能性內體的產生仍然受限于其不穩定性和不可溶性或者聚集的傾向。胞漿的還原環境防止形成保守的鏈內二硫橋，從而使得高百分比的抗體片段不穩定，因此在細胞內無功能(Biocca,1995;Proba,1997)。抗體片段的穩定性和可溶性因此構成了內體在體內作為潛在的蛋白功能調解劑的應用的主要障礙。迄今為止，尚不可預言使得抗體片段在胞內環境中具備功能的序列要求。?

因此，急需在廣范圍的不同細胞類型中性能良好的抗體片段，從而可作為用于多種結合特異性的構架。此類構架可用于構建用于胞內篩選的文庫，或者可作為既有抗體結合部分的受體。?

除了獨特地滿足胞內應用之外，在眾多的胞外和體外應用中，基于極為穩定的可變結構域構架的此類抗體片段或完整抗體相比于其它抗體也具有獨特的優勢。當此類構架在氧化環境中產生時，其二硫橋能夠形成，進一步增強其穩定性，并使得它們高度抵抗聚集和蛋白酶降解。體內半衰期(及針對聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了親和力和特異性之外的、使抗體在治療或診斷應用中成功的唯一最為重要的因素(Willuda,1999)。抗體片段的半衰期可通過共價連接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而進一步得以提高(Weir,2002)。這類穩定分子代表了抗體應用的顯著進步，尤其但并不僅當不期望F_C功能時。?

抗體片段文庫極大的實踐重要性激發了該領域的研究。Winter(EP?0368684)提供了抗體可變區基因的初始克隆和表達。由這些基因出發，他建立了在互補決定區(CDR)以及構架區具有高度多樣性的巨大抗體文庫。不過，Winter未披露不同構架用于文庫構建的用途。?