[發明專利]一種腫瘤細胞藥敏動態測定方法

在審

• 申請號: 201410031797.1
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN104122254A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 周英;俸婷婷;李宙陽;甄茹;劉雄利;王慧娟
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N21/78
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

技術領域

本發明涉及抗腫瘤藥物敏感性檢測技術領域，尤其是一種腫瘤細胞藥敏動態測定方法。?

背景技術

癌癥嚴重威脅著人類的健康和生命，每年約新增800萬癌癥患者，600多萬人死于癌癥，幾乎每6秒鐘就有一名癌癥患者死亡。在惡性腫瘤的療法中，藥物治療占有重要地位。由于現有的化療藥物副作用大，易產生耐藥現象，因此，尋找更為有效、低毒的抗腫瘤藥物仍是當前及今后一段時期內腫瘤治療的熱點。

隨著抗腫瘤藥物體外敏感性試驗深入的研究，目前已發展了不少新的測試方法，如MTT法、[3H]?TdR法、⁵¹Cr釋放法、LDH法、XTT法、MTS法、CCK-8試劑盒等，但這些方法在評價抗腫瘤藥物作用細胞的最佳作用時間時方面受到限制，如：[3H]?TdR法、⁵¹Cr釋放法具有放射性，操作繁瑣。后三種方法是類似MTT法原理的一種終點檢測法，只適于檢測藥物的終點作用效果，而不能動態測試抗腫瘤藥物的作用最適濃度和最佳時間。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種腫瘤細胞藥敏動態測定方法，它能同時快速、靈敏的測試抗腫瘤藥物作用最適濃度和最佳時間，以克服現有技術的不足。

本發明是這樣實現的：腫瘤細胞藥敏動態測定方法，包括以下步驟：（1）取對數生長期的腫瘤細胞計數，并制備細胞懸液，接種至細胞培養板；（2）向細胞培養板的對應孔中加入抗腫瘤藥物，每種抗腫瘤藥物設置四個濃度梯度，五個重復；（3）將細胞培養板置于CO₂培養箱中培養48h后，每孔加入刃天青溶液，繼續培養，并在培養過程的不同時間段內測量熒光強度值；（4）將測量的熒光強度值帶入公式（1）計算藥物對細胞增殖抑制率；計算比較，求得藥敏數值，判斷最適濃度和最佳時間；

公式（1）中，FLU表示熒光強度值。

步驟（1）中，細胞接種量為1×10⁵個/孔。

步驟（3）中，加入的刃天青溶液的濃度為75??g/mL；加入刃天青溶液后的反應作用時間為72h。

所述細胞培養板為96孔板。

步驟（4）中，熒光強度值測定激發波長為571.02nm，發射波長為583.97nm。

所述腫瘤細胞為人慢性髓系白血病細胞K562。

刃天青是一種氧化還原指示劑，活細胞中的乳酸脫氫酶經過一偶聯的酶促反應將刃天青轉化為試鹵靈，顯粉紅色并產生強熒光信號，試鹵靈可被活細胞進一步還原為二氫試鹵靈，呈無色并且無熒光信號。刃天青法因操作方便、快捷，常被用于檢測牛奶中的細菌污、抗菌藥物的抑菌活性、測定細胞毒性等，但鮮有研究報道刃天青法用于抗腫瘤藥物的活性測定，因此，應用刃天青法同時快速、靈敏的測試抗腫瘤藥物作用最適濃度和最佳時間，具有廣泛的應用前景。

為了確保本發明含量測定方法科學、合理、可行，特進行以下實驗：

一、供試材料

人慢性髓系白血病細胞K562，由天然產物生化所提供；絲裂霉素（MMC）、順鉑（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、刃天青、MTT，均購自Sigma公司；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；HEPES購自北京鼎國昌盛生物公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司）。

二、試劑的準備

刃天青用雙蒸水配成濃度5000??g/mL的原液，MTT用?pH6.8?的磷酸緩沖液（PBS）溶解成?5mg/mL?的貯存液，過濾除菌，分裝置于4℃避光保存。

三、細胞懸液的制備

????取對數生長期的細胞用血細胞計數板計數，調整細胞濃度為5×10⁵個/mL，備用。

四、刃天青法的條件優化