[發明專利]一種適于PCR擴增的燕麥種子DNA大量提取及純化方法

有效

• 申請號: 201410031477.6
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN104263719B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 侯雅君;潘韻;陳義昆;唐明輝;鄭文官;李永新
• 申請（專利權）人: 深圳市圣西馬生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 深圳力拓知識產權代理有限公司44313
• 代理人: 龔健

1.一種適于PCR擴增的燕麥種子DNA大量提取方法，其特征是，包括以下步驟:

(1)?選取燕麥干種子于預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末，將粉末放入第一離心管中；?

(2)?向第一離心管中加入經65℃預熱的提取緩沖液，充分顛倒混勻；

(3)?將第一離心管置于65℃中進行水浴，水浴1.5小時，水浴其間每10min溫和的顛倒混勻一次；

(4)?取出第一離心管，加入等體積的酚-氯仿（酚-氯仿溶液中，酚和氯仿的體積比為1:1）溶液，溫和顛倒混勻，離心；

(5)?離心結束后用吸管吸取上清液，裝入第二離心管，加入等體積的氯仿-異戊醇（氯仿-異戊醇溶液中，氯仿和異戊醇的體積比為24:1）溶液，充分顛倒混勻，離心；

(6)?離心結束后將上清液移入第三離心管中，加入預冷的異丙醇，輕輕混勻，低溫靜置；

(7)勾出DNA到第四離心管中，并用70％的乙醇沖洗2～3次；

(8)?用冷凍干燥機干燥DNA至無乙醇味，再加入1×TE?500μl，RNase?3-5μl，37℃水浴1-2h。

2.根據權利要求1所述的一種適于PCR擴增的燕麥種子DNA大量提取方法，其特征是，步驟(2)中，所述緩沖液成分為3%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、0.1mol/L?的Tris-HCl?(pH?8.0)、1.4mol/L?NaCl、0.02?mol/L?EDTA(pH8．0)、1%?PVP、1%?β-巰基乙醇。

3.根據權利要求1所述的一種適于PCR擴增的燕麥種子DNA大量提取方法，其特征是，步驟(2)?中,所述提取緩沖液的加入量為20-22ml。

4.根據權利要求1所述的一種適于PCR擴增的燕麥種子DNA大量提取方法，其特征是，步驟(2)至步驟(6)中，所用到的離心管均為50ml離心管。

5.根據權利要求1所述的一種適于PCR擴增的燕麥種子DNA大量提取方法，其特征是，步驟(4)?和?步驟(5)中，所述離心參數為6000-8000rpm，離心時間5-10min。

6.根據權利要求1所述的一種適于PCR擴增的燕麥種子DNA大量提取方法，其特征是，步驟(6)中，所述異丙醇的加入量為上清液體積的0.6-1倍。

7.一種如權利要求1所述的適于PCR擴增的燕麥種子DNA純化方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)?取出離心管，加入氯仿-異戊醇（氯仿-異戊醇溶液中，氯仿和異戊醇的體積比為24:1），輕輕混勻，12000?rpm，離心5min；

(2)離心結束后，取上清液于第二離心管，加0.1倍體積（相對于上清液體積）3M醋酸鈉，混勻后加入2倍體積（相對于上清液體積）預冷的無水乙醇，輕搖混勻，低溫靜置；

(3)?用移液器吸頭勾出DNA至第三離心管，然后用70%的乙醇沖洗2-3次；

(4)?將第三離心管放入冷凍干燥機中，干燥DNA至無乙醇味，依所提DNA的量加入適量的1×TE溶解，使其終濃度為190-210ng/μL。