[發明專利]快速鑒定與黃曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法

有效

• 申請號: 201410031331.1
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN103743913A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 莊振宏;黃亞玲;汪世華;袁軍
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于蛋白質工程領域，具體涉及一種通過固相層析篩選與黃曲霉毒素B₁結合的蛋白的方法及對其是否與AFB₁具有結合性的體外驗證分析。

背景技術

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所產生的代謝產物，對人和動物有極大危害。歷年來有大量關于真菌毒素污染糧食和作物，導致事物中毒事件的報道，其中常見到的真菌毒素有：黃曲霉毒素、黃綠青霉素、橘青霉素、T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌稀醇等。其中，黃曲霉毒素（Aflatoxins,?AFT）是主要由黃曲霉?（aspergillus?flavus）寄生曲霉?（Aspergillus?parasiticus）產生的次生代謝產物，污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品。黃曲霉毒素在?1993年被世界衛生組織的癌癥研究機構劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質，其毒性作用主要是對肝臟的損害。在天然食物中以黃曲霉毒素B₁（Aflatoxin?B₁,?AFB₁）最為多見，危害性也最強。動物實驗表明，AFB₁具有強肝臟毒性和致癌效應。

一直以來科學家圍繞AFB₁的產毒機理、毒素的致毒機理展開了大量研究，但由于該毒素是小分子的特點，針對毒素被動物細胞吸收的機理研究很少。本發明設計了一種快速鑒定與AFB₁互作的蛋白的方法，本發明通過固相親和層析法尋找出黃曲霉毒素的結合蛋白，利用該方法可以快速有效地找出與AFB₁互作的結合蛋白，為促進對該毒素的致毒機理的研究奠定基礎。本方法包含，將AFB₁與載體蛋白進行偶聯，將毒素與載體蛋白的偶聯復合物固定在PVDF膜上，讓偶聯復合物與宿主的總蛋白孵育，進行非特異性洗滌和特異性洗脫并進行質譜鑒定。通過該方法得到的AFB₁的互作蛋白準確度高，能為毒素被動物細胞吸收機理的研究打下基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速鑒定與黃曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法，通過固相層析篩選與黃曲霉毒素B₁結合的蛋白的方法，及對其與AFB₁是否具有結合性的體外驗證分析。經此方法的篩選和驗證，目前已經發現40S核糖體蛋白SA和雌二醇β脫氫酶5能與AFB₁結合，是AFB₁的互作蛋白。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種快速鑒定與黃曲霉毒素B₁互作的宿主蛋白的方法，是先將黃曲霉毒素B₁與牛血清白蛋白進行偶聯，再通過固相層析的方法，篩選與黃曲霉毒素B₁結合的蛋白，經質譜分析鑒定后，再通過體外結合實驗驗證蛋白與黃曲霉毒素B₁的結合性。

所述的通過固相層析的方法來篩選與黃曲霉毒素B₁結合的蛋白，是將牛血清蛋白-黃曲霉毒素B₁偶聯復合物展示在甲醇活化后的PVDF膜上，3-5℃過夜孵育；將孵育了牛血清蛋白-黃曲霉毒素B₁的PVDF膜用質量分數為2%?牛血清蛋白溶液進行封閉后，將膜置于小鼠肝臟總蛋白溶液中3-5℃過夜孵育以充分結合，同時用只展示牛血清蛋白分子的PVDF膜置于小鼠肝臟總蛋白溶液中作為陰性對照；再用3-5℃預冷的磷酸鹽緩沖液或磷酸鹽吐溫緩沖液進行非特異性洗脫，3-5℃振搖10min，洗滌四次，用2M的NaCl進行特異性洗脫，3-5℃振搖30min，洗脫液中的互作蛋白濃縮后進行SDS-PAGE分析，銀染后取差異條帶進行質譜分析鑒定。

所述的通過體外結合實驗驗證蛋白與黃曲霉毒素B₁的結合性，對經質譜鑒定的黃曲霉毒素B₁互作蛋白進行基因克隆、誘導表達、純化后，通過ELISA的方法驗證相應蛋白與黃曲霉毒素B₁的結合性；