[發明專利]一種利用海洋細菌交替假單胞菌MB004產的膠原蛋白酶基因的克隆表達方法

無效

• 申請號: 201410030498.6
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN103773787A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 周宇芳;朱鵬;相興偉;楊會成;肖金星;徐珊
• 申請（專利權）人: 浙江省海洋開發研究院;寧波大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N15/70;C12N9/52
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用海洋細菌交替假單胞菌MB004產的膠原蛋白酶基因的克隆表達方法。

背景技術

膠原是一種廣泛存在于動物的結構蛋白質，是由動物細胞合成的一種生物性高分子。廣泛存在于動物骨、腳、軟骨和皮膚及其它結締組織中，約占哺乳動物總蛋白的1/3。多數類型的膠原蛋白分子都由3條螺旋肽鏈相互盤繞而成，3鏈相互纏繞，形成了膠原蛋白分子特有的桿狀結構。膠原蛋白是一類重要的資源，目前，己廣泛地應用于醫藥工業、食品工業、日用化學品工業等方面都有重要的作用。

在飼料工業中：膠原蛋白作為一種高效的動物性蛋白營養添加劑。

在生物醫學材料方面的應用：制作心臟瓣膜；血管修復的替換血管裝置；作為燒傷傷口的敷料（使血液凝固，具有止血功能）；制造人造皮膚。

在食品方面：膠原蛋白材料制備薄膜材料；制造腸衣等可食用包裝材料；作為肉制品添加劑、保健食品等。

另外，膠原蛋白具有優良的吸濕、保濕性能以及抗皮膚衰老功效,一些知名品牌公司已推出了純膠原蛋白和一系列添加了純膠原蛋白的護膚品。

膠原蛋白得到了廣泛的應用，大量的需求突出了提取膠原蛋白迫切性，用膠原蛋白酶進行生產就是其中重要的一種方法。

膠原蛋白酶是指作用于膠原或其變性明膠而不作用其它蛋白質的酶類，它來源廣泛，多種微生物以及動物的許多組織細胞都可以產生膠原酶。膠原酶在環境保護上可用于皮革邊角廢棄物變廢為寶，高值轉化；在醫學研究中可用于治療腰椎間盤突出癥、瘢痕疙瘩、杜普伊特倫癥等，具有極大的應用價值。來自溶組織梭菌（Clostridium?histolyticum)、溶藻弧菌(Vibrio?alginolyticus)等的膠原蛋白酶已有廣泛的研究。目前，已從許多動物組織和微生物中獲得膠原蛋白酶。但對于來自于海洋微生物中的膠原蛋白酶的研究甚少，而海洋由于其多變復雜的環境，多樣的生命形式，使得海洋中蘊藏著種類多樣，功能各異且具有強烈活性的生物蛋白酶。本研究試從實驗室保存的海洋微生物中篩選膠原蛋白酶產生菌，并將其膠原蛋白酶基因導入工程菌中進行異源表達，對海洋來源膠原蛋白酶進行一個初探式研究。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是針對上述的技術現狀而提供一種利用海洋細菌交替假單胞菌MB004產的膠原蛋白酶基因的克隆表達方法。

一種利用海洋細菌交替假單胞菌MB004產的膠原蛋白酶基因的克隆表達方法，是以交替假單胞菌MB004基因組DNA為模板，該交替假單胞菌MB004的核苷酸序列如<400>1所述，用PCR方法克隆MB004的編碼基因，將該基因重組到表達質粒pET28a中，獲得重組質粒pET28a-Pnjc，將重組質粒線性化，以原生質體轉化的方法整合到大腸桿菌Rosseta感受態細胞中，獲得整合了質粒的重組表達菌株Rosseta(DE3)/pET28a-Pnjc，接種到LB培養基中培養誘導表達重組蛋白，重組蛋白以可溶性的形式分泌到培養液中，表達的蛋白經離心后收集，濃縮，經IPTG誘導表達、親和層析純化獲得重組蛋白純化產物。

進一步地，所述PCR方法中所用引物為：

引物P1：5’-CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3’；

引物P2：5’-CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3’；

并在引物p1和引物p2的5’端分別引入酶切位點BglⅡ和XhoⅠ位點。

進一步地，所述PCR方法中的PCR反應條件為：95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃90s，共35個循環；72℃延伸10min。

進一步地，所述交替假單胞菌MB004基因組DNA的克隆采用16S?rRNA通用引物27F和1492R進行PCR擴增，目的片段經回收純化后與pMD18-T?Vector連接，然后轉化到DH5α細胞，提取重組質粒進行目的片段的測序。

進一步地，所述引物27F為：5’-AGAGTTTGATCCTGGC-3’。

進一步地，所述引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。