[發明專利]百脈根特異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-2HA1-LTB融合表達載體

無效

• 申請號: 201410030497.1
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103865953A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 吳燕民;何景成;張偉偉;盧運明;袁蓓;王維部;周美亮;鄭平;唐益雄;陳肖英
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所;深圳市農科集團有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及百脈根特異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-2HA1-LTB融合表達載體。?

背景技術

H5N1高致病性禽流感病毒的不斷變異和可通過侯鳥遷徙傳播等特性，給傳統疫苗的研制及免疫途徑帶來了極大的困難。禽流感病毒具有極高的突變和重組頻率，加之其高毒性和潛在感染人的能力，使得禽流感的防控成為一個世界性難題。不斷蔓延的疫情給我們再一次敲響了警鐘，被動地根據發病病毒亞型進行治療往往具有滯后性和盲目性，且禽流感病毒具有宿主多樣化和隨候鳥遷徙等特點，只有建立成熟的疫苗生產平臺，研制可廣譜免疫中和多種亞型禽流感病毒的植物可飼疫苗，通過在候鳥遷徙地投放，才能從根本上控制甚至消滅禽流感病毒。?

禽流感毒株A/Hong?Kong/156/97(H5N1)血凝素基因（HA）序列（Genebank?No.AF028709.1）、蛋白序列（AAC40508.1），A/common?magpie/Hong?Kong/5052/2007(H5N1)血凝素基因（HA）序列（Genebank?No.CY036173.1）、蛋白序列（ACJ26242.1），A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)血凝素基因（HA）（Genebank?No.DQ914814.3）、蛋白序列（ABK34764.2）。此3株禽流感血凝素（HA）抗原蛋白包含所有H5HA蛋白的抗原表位，血凝素參與病毒與受體結合、細胞膜融合及進入細胞全過程，是流感病毒表面重要的糖蛋白。大腸桿菌熱敏毒素B亞基基因（LT-B）序列（Genebank?No.M17873.1）、蛋白序列（AAA98065.1）均來自Genbank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）大腸桿菌熱敏毒素B亞基（LTB）能刺激腸道上皮細胞，蹭墻黏膜細胞對抗原通透性，從而增強免疫反應，具有高活性、無毒性的特點。?

利用全價飼料豆科牧草——百脈根（Lotus?corniculatus）作為植物生物反應器生產廣譜（可免疫中和所有H5亞型禽流感病毒）禽流感轉基因植物可飼用疫苗，是解決這一難題的最有效的途徑。通過基因工程技術手段實現抗原蛋白在百脈根中的高水平表達，并在候鳥遷徙地投放轉基因植物疫苗，不僅可節省下游純化的成本，生產低成本的疫苗，更重要的是能夠切斷禽流感傳播途徑，實現根本上防控禽流感的?目的。?

發明內容

本發明的目的是提供百脈根特異性表達H5N1抗原蛋白的三價HA-2HA1-LTB融合植物表達載體。?

根據本發明的三價HA-2HA1-LTB融合植物表達載體，其特征在于，在百脈根植物表達載體的多克隆位點，由2E+35啟動子至poly(A)-Nos終止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示的優化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ?IDNo.4所示的優化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ?ID?No.6的優化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示的優化免疫佐劑LTB基因。?

根據本發明的三價HA‐2HA1‐LTB融合植物表達載體，其中所述百脈根植物表達載體為pCAMBIA2301。?

本發明分析H5HA蛋白抗原表位多態性，依據主要抗原位點氨基酸差異、宿主、病毒致病性強弱，選取包含所有突變抗原表位的三株H5N1高致病性禽流感毒株即：HK97HA-A/Hong?Kong/156/97（H5N1）、HK07HA1-A/common?magpie/Hong?Kong/5052/2007（H5N1）和SX06HA1-A/chicken/Shanxi/2/2006（H5N1），以其HA為目的抗原蛋白，構建三價HA-2HA1-LTB融合蛋白，并利用多種生物信息學軟件對融合蛋白的理化性質、二級結構及三級結構進行預測，結果顯示融合蛋白結構穩定、構象合理，具備了通過構建植物融合表達載體，實現在植物中穩定表達的基本條件。?

為進一步提高外源蛋白的表達水平，對目的抗原蛋白基因進行修飾改造。分別對HK97HA、HK07HA1、SX06HA1和免疫佐劑LTB基因進行密碼子優化，同時對各目的基因起始密碼子上游序列進行改造，修飾后基因進行全序列合成。?