[發(fā)明專利]菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族編碼序列及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410030374.8
• 申請日: 2014-01-23
• 公開（公告）號: CN104805096A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖瑩;周洵;楊穎博;陳萬生;張磊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;A01H5/00
• 代理公司: 上海德昭知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31204
• 代理人: 郁旦蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的核苷酸序列及其應(yīng)用，本發(fā)明還涉及菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

菘藍(lán)為十字花科植物，其根入藥，即為常用中藥板藍(lán)根，有清熱解毒，涼血利咽等功效，應(yīng)用十分廣泛，主要制劑有板藍(lán)根顆粒、板藍(lán)根含片等，臨床用于流行性感冒、流行性乙型腦炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、帶狀皰疹等。化學(xué)成分及藥理活性研究表明落葉松脂素是菘藍(lán)發(fā)揮抗病毒功效的重要活性物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，提高落葉松脂素的含量是獲得抗病毒活性高的優(yōu)良菘藍(lán)品系的關(guān)鍵，具有重要的應(yīng)用價值；同時，落葉松脂素屬于木脂素類成分，降低菘藍(lán)中落葉松脂素的含量，減少木質(zhì)化的程度，能有效降低以其作為原料轉(zhuǎn)化為生物燃料的難度，對于生物能源的生產(chǎn)也具有重要意義。

植物次生代謝工程是利用基因工程和分子生物學(xué)方法闡明植物次生代謝產(chǎn)物生物合成的機(jī)制，了解清楚代謝途徑和相關(guān)酶的信息，對控制生物合成路徑的基因進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到在分子水平上改造代謝途徑，調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物的定向合成，趨利避害，提高或降低植物中特定化合物產(chǎn)量的目的。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）對落葉松脂素的生物合成起到了非常重要的調(diào)控作用，是木脂素代謝工程的重要靶點(diǎn)。因此，從菘藍(lán)中分離獲得4-香豆酰輔酶A連接酶并利用其進(jìn)行目標(biāo)性的代謝調(diào)控，一方面有可能打破落葉松脂素生物合成限速瓶頸，獲得落葉松脂素高產(chǎn)的高品質(zhì)菘藍(lán)株系；另一方面有可能降低以落葉松脂素為代表的木脂素的含量，減少菘藍(lán)木質(zhì)化的程度，為生物能源的生產(chǎn)提供有效的原材料。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明所提及的菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白及應(yīng)用的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了編碼菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3所示。

本發(fā)明還提供了菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：其序列如SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5以及SEQ?ID?NO.6所示。

本發(fā)明還提供了一種通過調(diào)控菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A家族蛋白的表達(dá)以改變落葉松脂素的生物合成的應(yīng)用。

發(fā)明作用與效果

本發(fā)明提供了菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的三段編碼序列，分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3所示。

本發(fā)明還提供了菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：其序列如SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5以及SEQ?ID?NO.6所示。

本發(fā)明還提供了一種通過調(diào)控菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A家族蛋白的表達(dá)以改變落葉松脂素的生物合成的應(yīng)用。

附圖說明

圖1是Ii4CL蛋白的氨基酸序列與擬南芥中4CL蛋白氨基酸序列的比對；

圖2是Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3融合蛋白在大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中原核表達(dá)的SDS-PAGE檢測；

圖3是Ii4CL1、Ii4CL2、Ii4CL3經(jīng)純化的融合蛋白的SDS-PAGE檢測；

圖4是抑制Ii4CL1的株系與野生型株系的Ii4CL1的相對表達(dá)量；

圖5是抑制Ii4CL1的株系與野生型株系的落葉松脂素的含量對比；

圖6是抑制Ii4CL2的株系與野生型株系的Ii4CL2的相對表達(dá)量；

圖7是抑制Ii4CL2的株系與野生型株系的落葉松脂素的含量對比；

圖8是抑制Ii4CL3的株系與野生型株系的Ii4CL3的相對表達(dá)量；以及

圖9是抑制Ii4CL3的株系與野生型株系的落葉松脂素的含量對比。

具體實(shí)施方式

<實(shí)施例一>菘藍(lán)4-香豆酰輔酶A連接酶家族基因的克隆

1.組織分離

菘藍(lán)（I.indigotica）葉片采集自第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院植物園，采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。

2.mRNA的分離