[發(fā)明專利]紅錐SSR6標(biāo)記、引物對(duì)及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410029945.6
• 申請(qǐng)日: 2014-01-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103740710A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣燚;劉海龍;朱積余;黃榮林;姜英;何應(yīng)會(huì)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種紅錐SSR標(biāo)記，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列，微衛(wèi)星標(biāo)記編號(hào)為SSR6。

2.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述紅錐SSR標(biāo)記的引物對(duì)HZ6，其特征在于包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的堿基序列。

3.權(quán)利要求1所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于利用特定引物對(duì)HZ6對(duì)紅錐總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到簡(jiǎn)單重復(fù)序列；所述引物對(duì)HZ6包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的堿基序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

<1>紅錐總DNA提取與酶切

選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37℃下酶切一晚，65℃下10min滅活內(nèi)切酶；反應(yīng)體系20μL，包括2.0μL的10×Buffer，1.0μL的EcoRV內(nèi)切酶，2μL的DNA，15.0μL的滅菌雙蒸水；

<2>接頭的連接

將步驟<1>EcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭；20μL連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA4μL，上下接頭各100pmol；連接反應(yīng)在T4連接酶緩沖條件下進(jìn)行，T4連接酶1.0μL，連接酶buffer2.0μL；于16℃連接過(guò)夜；連接后的混合物在65℃反應(yīng)10min，滅活連接酶；

<3>連接產(chǎn)物的擴(kuò)增

過(guò)夜步驟<2>連接后的混合物以AP2和復(fù)合SSR引物為上下引物對(duì)連接后的混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2.0%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化；

<4>克隆并篩選富集的微衛(wèi)星DNA片段

將步驟<3>PCR產(chǎn)物連接到載體pMD18-T?Vectors上，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，選取400-1000bp左右的片段；

<5>測(cè)序、引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增分析

將步驟<4>PCR產(chǎn)物送測(cè)序；利用Primer5.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)并送合成，得引物對(duì)HZ6；利用引物對(duì)HZ6在紅錐基因組中擴(kuò)增出片段SSR6標(biāo)記。

5.權(quán)利要求4所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于：

步驟<2>中上下接頭分別具有序列表SEQ.ID.No.4和SEQ.ID.No.5的堿基序列；

步驟<3>中AP2和復(fù)合SSR引物分別具有序列表SEQ.ID.No.6和SEQ.ID.No.7的堿基序列；

步驟<4>中M13引物對(duì)具有序列表SEQ.ID.No.8和SEQ.ID.No.9的堿基序列；

步驟<5>中引物對(duì)HZ6分別具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的堿基序列。

6.權(quán)利要求5所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于步驟<5>中擴(kuò)增按以下操作進(jìn)行：擴(kuò)增體系：反應(yīng)體系10μL，包括30-50ng的模板DNA，0.25個(gè)單位的DNA聚合酶（TaKaRa），1.0μL的10×Buffer，2.5mM?MgCl₂1μl,2.5mM?dNTPs1μl,0.1μl?bovine?serum?albumin(BSA)；

擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,52℃復(fù)性45s,72℃延伸1min30s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。

7.權(quán)利要求1所述紅錐SSR6標(biāo)記在紅錐的分子標(biāo)記輔助育種方面的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述紅錐SSR6標(biāo)記在紅錐的QTL研究方面的應(yīng)用。