[發(fā)明專利]快速鑒定紅錐的PCR檢測(cè)方法及其引物對(duì)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410029308.9
• 申請(qǐng)日: 2014-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN103757119B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉海龍;蔡玲;朱積余;韋穎文;黃金使;覃玉鳳;曾永明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于林業(yè)科學(xué)中分子標(biāo)記鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速鑒定紅錐的PCR檢測(cè)方法及其引物對(duì)。

背景技術(shù)

紅錐（Castanopsis?hystrix）為殼斗科(Fagaceae)栲屬(Castanopsis)常綠喬木，是華南地區(qū)重要的鄉(xiāng)土闊葉、優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹種。它生長(zhǎng)快、適應(yīng)廣、效益高，可用做建筑、造船、高檔家具等；萌芽力強(qiáng)，枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可純林種植，亦可混交造林，是針葉樹種混交造林的最理想的伴生樹種之一；紅錐對(duì)生境適應(yīng)能力強(qiáng)，在群落中位于喬木層，為優(yōu)勢(shì)種，對(duì)于維持群落穩(wěn)定具有重要作用，特別適宜人工營(yíng)造用材林和水源涵養(yǎng)林。由于紅錐木材非常珍貴，近些年遭到了大量采伐，其天然林遭受了嚴(yán)重破壞。

紅錐與其近緣種白椎（Castanopsis?carlesii?Hayata）、越南白椎（Castanopsis?tonkinensis）之間很難從形態(tài)上區(qū)分開來。為有效開發(fā)利用該樹種，防止在選育、繁育和利用時(shí)與近緣種發(fā)生混淆，迫切需要一種快速鑒定紅錐的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效、準(zhǔn)確的快速鑒定紅錐的PCR檢測(cè)方法及其引物對(duì)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：快速鑒定紅錐的PCR檢測(cè)方法的引物對(duì)，包括引物cc1和引物cc2，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的堿基序列。

快速鑒定紅錐的PCR檢測(cè)方法，采用引物cc1和引物cc2對(duì)紅錐總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果；若用鑒定引物得到陽(yáng)性擴(kuò)增,則供試品為紅錐。

上述快速鑒定紅錐的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

<1>提取紅錐總DNA

摘取健康、干凈的葉片1～10片（要求葉片無病斑、無枯萎現(xiàn)象，幼嫩葉片效果更佳），用液氮處理葉片后進(jìn)行研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行總DNA的提取獲得基因組DNA模板，稀釋為50～80ng/μL，放置于冰箱-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

<2>PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系：25μL體系中含約60ng模板DNA，1.25U?Taq酶,1.5mmol·L^-1MgCl₂，0.25mmol·L^-1dNTPs，引物cc1和引物cc2各0.15μmol·L^-1。

擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，52℃復(fù)性45s，72℃延伸2min，35～39個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min；

<3>電泳檢查

PCR產(chǎn)物在含有GelRed的2%瓊脂糖凝膠中電泳，以100bp?Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，紫外自動(dòng)成像儀照相。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：若該樣品為紅錐，則可得到長(zhǎng)度為340bp的擴(kuò)增條帶；若樣品不是紅錐，則檢測(cè)不到擴(kuò)增條帶。

針對(duì)目前缺乏紅錐快速有效鑒定方法的問題，發(fā)明人開發(fā)了一對(duì)紅錐鑒定引物cc1和cc2。采用該引物對(duì)對(duì)紅錐總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，若得到陽(yáng)性擴(kuò)增，則供試品為紅錐，否則不是紅錐。由于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)成熟，所以該法具有較高的準(zhǔn)確性；而且整個(gè)檢測(cè)便捷、快速，實(shí)驗(yàn)時(shí)間不超過6個(gè)小時(shí)。因此，應(yīng)用本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)高效、準(zhǔn)確地鑒別紅錐。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1電泳檢查結(jié)果圖。

圖2是實(shí)施例2電泳檢查結(jié)果圖。

圖3是實(shí)施例3電泳檢查結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例所用鑒定引物cc1（5’-gacagacagacagacagttc-3’）和cc2（5’-gacagacagacagacaactg-3’）采用全自動(dòng)DNA合成儀合成而得。引物為白色粉末結(jié)晶，采用純凈水將引物溶解至終濃度100μmol·L^-1，震蕩混勻后，放置于冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例1

<1>提取樣品總DNA

摘取健康、干凈的葉片1片（疑似紅錐樣品，來源于廣西林科院樹木園），用液氮處理葉片后進(jìn)行研磨，采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生物）進(jìn)行總DNA的提取獲得純度符合要求的基因組DNA模板，稀釋為50ng/μL，放置于冰箱-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

<2>PCR擴(kuò)增