[發明專利]人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201410028810.8
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103866046A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 陶然;尚世強;舒強;杜立中;李偉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及熒光定量PCR檢測試劑盒，具體涉及一種雙探針實時熒光定量PCR同時檢測患者血液、尿液、腦脊液等樣本中愛潑斯坦－馬爾病毒（Epstein-Barr?virus,?EBV）和水痘－帶狀皰疹病毒（varicella-zoster?virus,?VZV）的診斷試劑盒。

背景技術

EBV和VZV是引起兒童病毒性腦炎的常見人皰疹病毒。EBV侵犯中樞神經系統后，可導致腦水腫、出血、免疫復合物沉積、腦組織脫髓鞘樣改變等，臨床可表現為急性起病或慢性活動性損害。急性EBV腦炎多為病毒直接侵入神經系統，如腦膜、腦組織和脊髓、外周神經多個部位的神經軸索；慢性EBV腦炎則與自身免疫反應有關，為免疫復合物的沉積、感染后炎性反應造成的腦組織脫髓鞘樣改變。VZV初次感染引起水痘，主要發生于兒童；水痘痊愈后病毒潛伏于神經節細胞，再激活引起帶狀皰疹。VZV腦炎常發生于出疹后1周內，其發病機制可能為病毒直接侵犯中樞神經系統，也可能為免疫反應損傷所致。此外，還有同時感染EBV和VZV繼發病毒性腦炎的病例報道，兩種病毒間可能存在相互促進激活的情況。

EBV和VZV感染的早期診斷和及時抗病毒治療對可明顯改善預后，降低病死率。因EBV和VZV感染的臨床表現多樣，且與其他皰疹病毒相比臨床癥狀和體征多無特異性，因此早期診斷和及時治療需依賴實驗室檢測。傳統的EBV和VZV檢測方法主要包括病毒分離培養和血清學檢測，前者曾為皰疹病毒的診斷“金標準”，但存在需時長（3-30天）、敏感性低（尤其在抗病毒藥物治療后）、分型困難等缺陷；后者又分為抗原直接檢測法和抗體間接檢測法，抗原直接檢測法由于某些病毒不產生可檢測的抗原而導致敏感性低，抗體間接檢測法由于皰疹病毒感染后需1周左右才產生有效濃度的抗體而無法進行早期診斷，且不同皰疹病毒間存在交叉反應，抗體特異性不高。

隨著分子生物學技術的迅速發展，聚合酶鏈反應（polymerase?chain?reaction,?PCR）技術，特別是近幾年興起的實時熒光定量PCR技術為病原微生物的檢測提供了新方向。實時熒光定量PCR技術的基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通PCR基礎上設計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團（R）和淬滅基團（Q）；探針保持完整時R基團的熒光信號被Q基團抑制，一旦探針被切斷，Q基團的抑制作用消失，R基團的熒光信號就可被檢測到。該技術通過對熒光信號的檢測實現對PCR過程中產物量的實時監測，并可精確計算初始模板量，除具有定量準確、檢測快速等優點外，最大的優勢是采用完全閉管檢測，省去了對PCR產物的后處理，避免了交叉污染。

目前的實時熒光定量PCR技術隨著材料和儀器的進一步發展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料（FAM、HEX、ROX等）及多通道熒光定量PCR儀，可以實現基因分型、基因突變檢測、SNP分析等研究。本發明基于上述技術背景，設計針對EBV和VZV的特異性探針，開發能一步法同時檢測和定量EBV和VZV的熒光定量PCR試劑盒，旨在滿足臨床EBV和VZV感染早期、快速診斷的需求，為臨床及時進行針對性治療提供依據。

發明內容

本發明提供一種人皰疹病毒EBV和VZV檢測試劑盒，是一種實時熒光定量PCR檢測試劑盒，由定量PCR反應液、EBV標準品、VZV標準品、EBV陽性對照品、VZV陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、EBV上游擴增引物、EBV下游擴增引物、VZV上游擴增引物、VZV下游擴增引物、EBV熒光探針和VZV熒光探針。

PCR擴增引物序列為：

EBV上游擴增引物序列（SEQ?ID?No：1）：5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’；

EBV下游擴增引物序列（SEQ?ID?No：2）：5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’；

VZV上游擴增引物序列（SEQ?ID?No：3）：5’-TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’；

VZV下游擴增引物序列（SEQ?ID?No：4）：5’-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3’。

EBV熒光探針序列（SEQ?ID?No：5）：5’FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’；

VZV熒光探針序列（SEQ?ID?No：6）：5’HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’；