[發明專利]一種染色體整合的人皰疹病毒6型的PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201410028660.0
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103757136A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 周鋒;李凌云;馮東舉;王芳;姚堃;陳云;劉英霞
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 孫忠浩

技術領域

本發明涉及一種基因檢測技術，特別是一種染色體整合的人皰疹病毒6型的PCR檢測試劑盒。

背景技術

????人皰疹病毒6型(Human?Herpesvirus?6,?以下簡稱HHV-6)，是一類嗜人淋巴細胞的雙鏈DNA病毒，于1986年由美國癌癥中心的Salahuddin等首先從淋巴增生及AIDS病人的外周血單個核細胞中分離得到，屬于β皰疹病毒亞科。HHV-6在體內可感染多種細胞，但最敏感的是外周血單核細胞(Peripheral?blood?mononuclear?cells,?PBMCs)中的CD4+T細胞。HHV-6在人群中普遍感染，血清HHV-6?IgG抗體陽性檢出率很高。原發感染大都在嬰兒期，是引起嬰幼兒急疹(exanthem?subitum,?ES)的病原，隨后潛伏并持續存在于宿主體內，不引起臨床癥狀。當人體受到各種非特異性刺激、機體抵抗力減弱、免疫功能低下時，容易發生HHV-6的再激活或外源性再感染。臨床研究表明HHV-6與多發性硬化癥(MS)等中樞神經系統疾病相關；它是骨髓移植、器官移植等免疫抑制患者中的主要致病性病原，也是引起嚴重移植物被排斥的重要病因；HHV-6在HIV感染后發展成AIDS過程中起促進作用；此外，HHV-6也是一腫瘤相關病毒，其DR7基因具有轉化能力，發現其與人類多種腫瘤如淋巴瘤、白血病、口腔癌等有關。

????HHV-6與其他皰疹病毒一樣，病毒顆粒呈球形，有包膜，平均直徑約為150納米（nm)。基因組為線狀雙鏈DNA。其核衣殼與包膜之間為基質蛋白組成的皮層（Tegument），它是人類皰疹病毒家族中唯一可以整合到人類染色體末端的病毒，在此情況下HHV-6的完整基因組可以整合到人類染色體的端粒末端，稱為染色體整合的人皰疹病毒6型(Chromosomally?integrated?HHV-6，以下簡稱CI-HHV-6)。國外研究表明，健康人群中HHV-6的整合率為1%左右，在腦炎患者中整合率為3%?，并且整合的HHV-6可以游離下來，引起HHV-6的再激活。因此檢測人群中CI-HHV-6的發生率，以及CI-HHV-6與HHV-6相關疾病的發生是否有相關性顯得尤為重要。

?????在感染CI-HHV-6個體中，每個有核細胞都穩定整合一份HHV-6完整基因組，并以50%的概率穩定傳給后代。在人群中，潛伏感染的非染色體整合形式的HHV-6病毒在全血中含量很低，通常利用巣式PCR在人外周血中檢測HHV-6?DNA，但巣式PCR檢測靈敏度極高，極易受空氣中微量的氣溶膠的污染，導致檢測結果假陽性；CI-HHV-6可通過染色體熒光原位雜交（fluorescence?in?1?situ?hybridization?，FISH)檢測，但FISH技術首先需要培養人外周血細胞，制備人類中期染色體，合成HHV-6特異性熒光探針，并進行雜交后洗脫，檢測周期長，假陽性高；另外CI-HHV-6也可通過熒光定量PCR（以下簡稱Q-PCR）檢測，但Q-PCR檢測需要特異的引物、探針和Q-PCR酶，并且需要專門的熒光定量PCR儀，檢測成本比較高，不利于大規模人群普查重復使用。

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發明內容

針對目前CI-HHV-6檢測存在的不足，提供一種操作簡單，靈敏度高，可用于CI-HHV-6快速診斷與流行病學調查的試劑盒，本發明是這樣實現的：

????一種染色體整合的人皰疹病毒6型的PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括：

A）DNA提取劑：紅細胞裂解液、Proteinase?K溶液、DNA抽提液、NaAc、無水乙醇、體積比為75%乙醇、?TE緩沖液；其中，所述紅細胞裂解液配方為139.6?mmol/L?NH4Cl溶液中加入16.96?mmol/L?Tris-HCl；DNA抽提液為體積比為25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇；TE緩沖液配方為10mmol/L?Tris-HCl溶液中加入1mmol/L?EDTA；

B）PCR試劑管成分：2×Taq?Master?Mix?15μl、ddH₂O?11μl、1.0μl濃度為10μM的引物SEQ?ID?No.1?以及1.0μl濃度為10μM的引物SEQ?ID?No.2?；

其中SEQ?ID?No.1：5'?-GTTGACGGTGGAAGCCTTTTTA?-3'；

SEQ?ID?No.2：5'-?TTTAGCGGGGACCATGTAGTTG?-3'；

C）陰性對照：已滅菌的雙蒸水；

D）陽性對照：人皰疹病毒6型標準株GS?DNA?。