[發明專利]斜帶石斑魚抗菌肽LEAP-2基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201410027857.2
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103755795A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 王維娜;謝福星;劉媛
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;A61K38/17;A61P31/04;A23K1/17;A23K1/18;C12R1/84
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種抗菌肽LEAP-2前體蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應用；還涉及一種LEAP-2成熟肽蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應用。

背景技術

抗菌肽是生物體內產生的一種具有生物活性的天然小分子多肽，在多種生物體中廣泛存在，是生物體免疫系統的一個重要組成部分。自從Steiner于?1981年首次在昆蟲體內發現抗菌肽的存在以后，到目前為止人們已經在多個物種中發現了上千種抗菌肽。同時，人們也發現了抗菌肽可以作用于G⁺和G^—細菌、真菌、寄生蟲甚至病毒，并且不會對正常細胞產生危害以及產生耐藥性。

LEAP-2全稱為肝臟表達的抗菌肽-2（liver-expressed?antimicrobial?peptides-2），屬于抗菌肽的一種。它是2003年Krause等在人類血液中首次發現的。LEAP-2最初在肝臟中以前體的形式合成，之后被轉運到血液中。在此過程中，LEAP-2被修飾和加工形成成熟肽，主要涉及信號肽的切除和二硫鍵的形成。LEAP-2前體蛋白一般包括100個氨基酸左右，成熟肽一般包括約40個氨基酸。LEAP-2的蛋白結構與其它抗菌肽蛋白結構存在很大不同，其最主要的特點是多肽序列中包含四個半胱氨酸，并且這四個半胱氨酸可以以1-3、2-4的形式形成兩個二硫鍵。再通過氫鍵的作用，LEAP-2成熟肽最終可以形成β折疊等高級結構。另外，研究發現LEAP-2具有與一般抗菌肽相同的廣譜抑菌能力。

石斑魚類隸屬鱸形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑魚亞科(Epinephelinae)，石斑魚屬(Epinephelus)，為暖水性礁棲魚類，廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域。石斑魚是馳名世界的名貴海產魚類之一，其肉質鮮美，營養豐富，為餐桌中的上等佳肴，被港澳地區推為我國的四大名魚之一，深受各地消費者的喜愛，經濟價值巨大。但是，當前氣候災害和環境污染導致的高致病率和高死亡率，一直是石斑魚人工養殖過程中難以解決的問題。市場上還沒有一種能夠有效增強石斑魚免疫力或不產生耐藥性的飼料添加劑。

酵母是最簡單的真核生物，以其作為宿主表達外源蛋白有很大的優勢：生長繁殖快，易培養，操作簡單；能對表達的外源蛋白進行翻譯后加工修飾，如糖基化、乙?；?；安全性高，無致病性。巴斯德畢赤酵母是一種甲醇營養型酵母，能將甲醇作為代謝的唯一碳源和能源。畢赤酵母表達系統有很多優點在科研及生產中廣泛應用：使用強的可誘導啟動子-AOX1基因啟動子；外源基因以單拷貝或多拷貝定點整合入基因組中，遺傳穩定性好；重組蛋白以高水平分泌到幾乎無蛋白的培養基中，利用表達蛋白的純化；容易進行高密度發酵，適合于產業化生產。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白。

本發明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白的基因。

本發明的另一目的在于提供一種石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白。

本發明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的野生型基因以及經密碼子偏好性改造后的基因mLEAP-2。

本發明的另一目的在于提供含有石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白基因或LEAP-2成熟肽蛋白基因的克隆載體或表達載體。

本發明的另一目的在于提供一種石斑魚抗菌肽LEAP-2重組前體蛋白及其制備方法。

本發明的另一目的在于提供石斑魚LEAP-2前體蛋白和/或LEAP-2成熟肽蛋白的應用。

本發明所采取的技術方案是：

石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，或者是SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。

編碼石斑魚抗菌肽LEAP-2前體蛋白的基因，其含有SEQ?ID?NO.1第262-561?bp所示的核苷酸序列。

石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，或者是SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。

編碼石斑魚抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的基因，其為SEQ?ID?NO.1第421-561?bp所示的核苷酸序列，或者是SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。