[發(fā)明專利]抗CD24單克隆抗體、其可變區(qū)序列及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410027795.5
• 申請(qǐng)日: 2014-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN103819561A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王旻;涂孝潔;何花;張娟;羅晨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/30
• 分類號(hào): C07K16/30;A61K47/42;A61P35/00
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能特異性結(jié)合人白細(xì)胞分化抗原CD24的單克隆抗體、其可變區(qū)序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人白細(xì)胞分化抗原CD24(cluster?of?differentiation?24)是一種新近發(fā)現(xiàn)并重點(diǎn)研究的腫瘤標(biāo)志物。

當(dāng)前研究表明，CD24分子是表觀分子量介于30～70kDa之間的高度糖基化唾液酸糖蛋白。CD24包含33個(gè)氨基酸殘基組成的核心蛋白骨架結(jié)構(gòu)，具有16個(gè)潛在的O-或N-糖基化位點(diǎn)，與小鼠熱穩(wěn)定抗原高度同源；其成熟多肽能夠通過羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)錨定在細(xì)胞膜的表面。

在生理情況下，CD24分子僅在未成熟B細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞以及少數(shù)上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞上低水平表達(dá)；而當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的表面均能檢測(cè)到顯著高水平表達(dá)的CD24分子，其表達(dá)水平的高低與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

P選擇素表達(dá)于活化的血小板與內(nèi)皮細(xì)胞表面，CD24是其配體之一。CD24分子高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)血小板及內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用，促進(jìn)了腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，作為細(xì)胞膜表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，CD24能夠通過多種作用機(jī)制介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的的增殖、粘附、轉(zhuǎn)移和侵襲。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CD24表達(dá)與肝癌細(xì)胞的干性緊密相關(guān)，CD24可能成為一種新的肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物。

由此可見，CD24有望成為研究腫瘤發(fā)生機(jī)制及開發(fā)相關(guān)診斷試劑的新靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的一在于提供一種抗CD24單克隆抗體制備方法。

本發(fā)明目的二在于提供了一種抗CD24單克隆抗體。

本發(fā)明目的三在于提供抗CD24單克隆抗體的可變區(qū)氨基酸序列。

本發(fā)明以CD24核心區(qū)多肽與血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)物(CD24-KLH)作為免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾臟細(xì)胞并將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得了可表達(dá)抗CD24抗體的雜交瘤細(xì)胞株，此細(xì)胞株可用于制備抗CD24單克隆抗體。

本發(fā)明克隆的抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及其高變區(qū)如有SEQ?ID?No.1～16所示。

本發(fā)明的單克隆抗體可與CD24特異性結(jié)合。

附圖說明

圖1為SDS-PAGE檢測(cè)Protein?G親和層析柱純化產(chǎn)物結(jié)果。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道1為腹水樣品；泳道2為上樣收集液；泳道3為20mM磷酸鈉緩沖液洗柱收集液；泳道4～6為100mM甘氨酸緩沖液(pH3.5)洗脫收集液(每分鐘收集1?ml，共收集3ml)，泳道7～10為100mM甘氨酸緩沖液(pH2.7)洗脫收集液(每分鐘收集1ml，共收集4ml)。

圖2為Western?Blot鑒定純化后抗體與CD24之間相互作用。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道1市售CD24-Fc(購自北京義翹神州)；泳道2為市售Fc(購自北京義翹神州)。

圖3為PCR擴(kuò)增抗體重輕鏈可變區(qū)基因瓊脂糖電泳結(jié)果。泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA；泳道1為PCR擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因產(chǎn)物；泳道2為PCR擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)基因產(chǎn)物。

圖4為競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定單克隆抗體G7、A7、E4、G5、B4親和力。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1抗CD24單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備

1.免疫原

CD24核心區(qū)由33個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量約為3.2kD，免疫原性較弱。本發(fā)明將抗原肽CD24與血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)，以偶聯(lián)物CD24-KLH作為免疫原，增強(qiáng)了CD24核心區(qū)多肽的免疫原性。本發(fā)明所用CD24-KLH由生工生物(上海)有限公司合成，純度＞90％。

2.免疫動(dòng)物

本發(fā)明所用免疫動(dòng)物為BALB/c小鼠，為SPF級(jí)別，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)院提供。免疫佐劑為QuickAntibody，購自北京康碧泉公司。免疫流程參照QuickAntibody說明書進(jìn)行，具體如表1所示。

表1.免疫途徑與周期

3.細(xì)胞融合

1)細(xì)胞準(zhǔn)備