[發明專利]一種高效制備重組人MICA蛋白的方法

無效

• 申請號: 201410027717.5
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103789340A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 肖衛華;鐘永軍;馬佳佳;鄔婧;仰露;康文瑤;田志剛
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C07K14/47;C12R1/84
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，更具體地涉及畢赤酵母生產重組人MICA蛋白的方法。?

背景技術

MICA是mic基因家族的一個成員，位于6號染色體距離HLA-B基因座著絲粒端約46.5kb處，屬于非經典的HLA-1類基因。正常生理條件下，其編碼的蛋白存在于細胞表面，且被高度N-糖基化修飾。區別于經典的MHC?I類分子，MICA不與beta-2-微球蛋白結合形成異二聚體。作為NKG2D的受體，MICA被認為直接參與了NK細胞介導的殺傷腫瘤功能。此外，Bauer等證實MICA作為NKG2D的配體在器官移植所引起的免疫反應方面也發揮著重要的作用(Bauer,S.,V.Groh等(1999).Activation?of?NK?cells?and?T?cells?by?NKG2D,a?receptor?for?stress-inducible?MICA.Science285(5428):727-729)。?

本發明前，市場上出售的重組人MICA主要是用大腸桿菌和人的細胞系進行重組表達的。眾所周知，現有的大腸桿菌系統不具備對重組表達的蛋白進行翻譯后修飾，特別是N-糖基修飾。在大腸桿菌中重組表達的蛋白多以包涵體的形式存在，涉及復雜的變復性過程，且整個系統會產生大量的內毒素等諸多不利因素。人的細胞系等動物細胞表達系統通常需要消耗大量的血清而大大增加了生產成本，且生產周期和生產設備要求高，但產量卻很有限。值得注意的是，有很多的研究顯示了動物細胞系統所生產的蛋白產品具有潛在的病毒污染風險。此外，曹利平等公開了一項MICA蛋白的制備方法專利(CN102154302A)，他用重組的桿狀病毒DNA轉染Sf9昆蟲細胞來重組表達和制備MICA蛋白。由于該方法采用了桿狀病毒系統，有直接的病毒污染的可能性，不符合目前關于臨床注射用治療性蛋白的標準。同時，Sf9昆蟲表達系統具有一般動物細胞表達系統所含有的缺?點。?

盡管畢赤酵母被廣泛用于嘗試表達各種人來源的重組蛋白，但是由于不同的蛋白本身具有復雜性和特殊性，因而最終的表達和制備效果是無法預測的。同時，成功地利用畢赤酵母來重組表達和制備MICA蛋白目前還沒有報道。?

綜上，當前急需要一種簡便，活性高，產量高和有產業化應用前景的重組人MICA蛋白的制備方法。?

發明內容

本發明的技術方案?

本發明提供了一種利用畢赤酵母表達和制備重組人MICA蛋白的方法。?

本發明的方案-1提供了在畢赤酵母中利用甲醇誘導表達重組人MICA蛋白的方法，其包括了重組表達質粒的構建、甲醇誘導重組蛋白的表達和重組蛋白的純化方法。?

本發明的方案-2提供了在畢赤酵母中利用組成型表達(非甲醇誘導)重組人MICA蛋白的方法，其包括了重組表達質粒的構建、重組蛋白表達和重組蛋白的純化方法。?

具體而言，方案-1和方案-2都包含以下步驟：?

(1)構建組成型表達載體，其包含啟動子、終止子、抗生素抗性基因、分泌信號肽和MICA的編碼序列；?

(2)電轉畢赤酵母，利用抗生素濃度梯度來篩選高效表達克隆；?

(3)MICA蛋白的表達和純化；?

在本發明的一方面中，所用的分泌信號肽為α-factor的Pre序列(SEQ?ID?No:1)，而非完整的α-factor?Pre-Pro序列(SEQ?ID?No:2)。?

在本發明的另一方面中，所用的MICA的編碼序列是未經密碼子優化的序列。?

在本發明的另一方面中，所用的MICA的編碼序列是經密碼子優化的序列。對編碼序列進行密碼子優化以利于在宿主細胞中表達的方法是本領域技術人員熟知的。?

在本發明的另一方面中，所表達的MICA蛋白的C末端不帶有6×His標簽。?

在本發明的另一方面中，所表達的MICA蛋白的C末端帶有6×His標簽。?

在本發明的方案-1的一個方面中，所構建的甲醇誘導MICA表達載體包含的啟動子為AOX1轉錄啟動子，終止子為AOX1轉錄終止子，抗性基因為Zeocin抗性基因，分泌信號肽為α-factor的Pre序列，MICA的編碼序列為人MICA(AAH16929.1)胞外區編碼序列(Glu24-Gln308)。?