[發明專利]家蠶W染色體適合轉基因定點插入的靶序列及其位點和應用

有效

• 申請號: 201410027716.0
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN103725676A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 夏慶友;蔣亮;孫強;劉緯強;郭慧珍;彭正文;黨穎慧
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種核苷酸序列，具體涉及家蠶W染色體上適合轉基因定點插入的靶序列及其位點，還涉及該靶序列和位點在轉基因定點插入報告基因表達盒中的應用。

背景技術

家蠶是具有重要經濟價值的鱗翅目昆蟲，蠶絲業是許多地區農民的主要經濟收入來源之一，蠶絲業為世界經濟、文化、社會發展做出了重要貢獻。優良蠶品種選育一直都是蠶業科學研究的重點和蠶桑業發展的基礎，傳統良種選育的主要目標是高產和優質。

家蠶的體細胞染色體數是28對，其中27對是常染色體，另外一對是性染色體。在雌蠶中，性染色體不成對，叫做ZW；在雄蠶中成對，叫做ZZ。雌蠶可以產生兩種卵，一種是27+W，一種是27+Z，兩種卵的比數相等；而雄蠶只能產生一種精子，即27+Z。帶有W的卵跟帶有Z的精子結合，得到ZW合子，發育成為雌蠶；帶有Z的卵跟帶有Z的精子結合，得到ZZ合子，發育成為雄蠶。因此，家蠶是ZW型性決定，雌蠶是異配性別，雄蠶是同配性別，下代個體的性別是由卵細胞帶的是Z染色體還是W染色體決定。

蠶種分為母種和雜交種，蠶種生產單位飼養母種并制備雜交種，蠶農飼養雜交種。雄蠶在體質抗性、飼料效率、繭絲品質等方面都優于雌蠶，因此蠶農希望能夠單養雄蠶。但蠶種生產單位必須同時飼養多個母種的雌雄個體，并在制種前將雌雄個體分開，以防止自交。在短短的幾天蛹期對大量的蠶蛹進行雌雄鑒定，不但工作量非常大，而且不能保證100%正確。培育具有W染色體連鎖標記基因的限性品種成為解決以上兩個問題的有效方法，限性品種能夠根據其限性特征在非破壞條件下鑒別雌雄。培育限性品種的傳統方法主要是通過雜交的方式，將已有限性品種的卵色、體色、繭色等限性性狀導入實用品種，再經過很多代長時間的回交選純，最后培育成生產品種。但是，這種方法具有很大局限性，比如：在導入限性性狀的同時帶入了其他不良性狀、限性性狀不穩定導致后代出現分離、選育周期過長，等等。因此，要克服傳統育種方法的這些缺點，需要利用新的技術和方法。

轉基因技術是將人工分離和修飾過的基因片段導入到生物體基因組中的一種方法，導入基因的表達將引起生物體性狀的可遺傳修飾。目前，轉基因技術已經成為現代生物學研究中的一項重要技術，在基因功能研究、生物素材創新、品種遺傳改良等方面發揮著重要作用。合適的轉座子是轉基因成功的重要條件，piggyBac轉座子首次從桿狀病毒侵染粉紋夜蛾（Trichoplusia?ni）昆蟲TN-368細胞株系時分離得到，它是一種DNA型轉座子。piggyBac轉座子長2476bp，含有ITR（13bp）和2個RNA聚合酶Ⅱ啟動子及1個聚腺苷酸信號，在該信號的側面是一個編碼轉座酶的ORF，該轉座子總是在TTAA目標位點處特異插入。piggyBac轉座子能夠準確切除DNA片段并將其插入到基因組中，插入片段遵循孟德爾遺傳規律被穩定遺傳；而且它攜帶的基因片段大小沒有限制，引起的染色體整合頻率也較高。因此，piggyBac轉座子目前已經在很多物種中廣泛使用。經過研究人員的長期摸索證明，piggyBac轉座子是最適合家蠶轉基因的轉座子。

利用轉基因技術，在W染色體特異插入一個標記基因或者條件性致死基因，是制備雌特異轉基因家蠶的有效方法。但是，家蠶W染色體上面包含大量的重復序列，基因組測序工作目前尚未完成，而且W染色體上的大量轉座元件會抑制插入基因的表達。因此，要找到一條適合轉基因插入的W染色體序列非常困難。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供家蠶W染色體上適合外源片段定點轉基因插入的靶序列；本發明的目的之二在于提供家蠶W染色體適合轉基因定點插入的位點；本發明的目的之三在于提供家蠶W染色體適合轉基因定點插入的位點的應用。

為實現上述發明目的，提供如下技術方案：

家蠶W染色體適合轉基因定點插入的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.19所示。

優選的，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.19第1-120位所示。