[發明專利]H5N1禽流感病毒樣顆粒及其應用和制備方法、疫苗

無效

• 申請號: 201410025271.2
• 申請日: 2014-01-20
• 公開（公告）號: CN103740655A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 曲新勇;陳文彬
• 申請（專利權）人: 瑞鑫百奧生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/81;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所 44275
• 代理人: 張明

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種H5N1禽流感病毒樣顆粒及其應用和制備方法、疫苗。

背景技術

高致病性禽流感的廣泛傳播和相繼的人類感染使我們認識到人類正面臨由H5N1型禽流感病毒引起流感大流行的危險。已經有50多個國家從禽類中分離到高致病性H5N1禽流感病毒。首例H5N1人禽流感病例于1997年出現在香港，而基因組分析結果表明此株H5N1病毒的HA基因來源于1996年廣東省鵝H5N1分離毒株；華南地區（特別是廣東）四季特征不明顯，是鳥類遷徙的中轉地，幾次流感大流行都發源于此，一直被認為是世界流感的發源地之一。

病毒樣顆粒(Virus-Like?Particles，VLPs)是含有病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復制，其在形態上與真正病毒粒子相同或相似，可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，有效誘導機體免疫系統產生免疫保護反應。病毒衣殼蛋白一般具有天然的自裝配能力，并且VLPs沒有感染性，穩定性好，不易失活，可以制備為良好的疫苗。利用基因工程的分子克隆、合成既具有病毒穩定的自然形態、又具有病毒完整的免疫原性、但又沒有病毒任何的感染源性的病毒樣顆粒VLP，要求同時具備病毒分子生物學、載體系統的結構生物學、生物工程和發酵工程等諸方面的知識、技術和工藝手段。因此，到目前為止，在病毒疫苗的研究領域，國際上僅有默克公司的用于預防子宮頸癌的人乳頭瘤狀病毒HPV的VLP疫苗上市。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用面包酵母高效生產高致病性H5N1禽流感病毒樣顆粒及其應用和制備方法、疫苗。

本發明的一個技術方案為提供一種H5N1禽流感病毒樣顆粒，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No：l，所述NA蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No：3，所述M2蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No：5。

優選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒中，所述HA蛋白核苷酸序列為SEQ?ID?No:2，所述NA蛋白的核苷酸序列為SEQ?ID?No:4，所述M2蛋白的核苷酸序列為SEQ?ID?No:6。

本發明的另一技術方案為提供一種含有上述H5N1禽流感病毒樣顆粒的疫苗。

優選的，上述的疫苗為固態制劑、肌注或噴霧型液態制劑。

本發明的另一技術方案為提供一種H5N1禽流感病毒樣顆粒的用途，用于制備預防禽流感病毒相關疾病的組合物。

本發明的另一技術方案為提供一種H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟：將人工合成的禽流感病毒基因克隆到克隆載體中，所述禽流感病毒基因的核苷酸序列為SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4和SEQ?ID?No：6依次的組合，將克隆載體的禽流感病毒基因連入重組表達載體，將重組表達載體轉入到酵母感受態細胞中進行發酵培養，培養后將培養物純化即得H5N1禽流感病毒樣顆粒。

優選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述克隆載體為PVD5質粒。

優選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述重組表達載為PTG3828質粒。

優選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述酵母感受態細胞為C13BYS86。

優選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述步驟“將重組表達載體轉入到酵母感受態細胞中進行發酵培養，培養后將培養物純化即得H5N1禽流感病毒樣顆粒”具體為：將重組表達載體轉染酵母感受態細胞C13BYS86，經30℃，72小時震蕩培養飽和培養后，進行1分鐘超聲波裂解，3000rpm高速離心除細胞碎片，收集上清即為液態免疫原的H5N1禽流感病毒樣顆粒。

本發明有益效果：本發明利用酵母表達系統最嗜好的核苷酸密碼子，大片段合成HA、NA、M2結構蛋白的基因，構建HA、NA、M2在酵母表達系統的重組表達載體，并經面包酵母工程菌轉染，制備高致病型禽流感病毒樣粒子。

附圖說明

圖1為H5N1禽流感病毒樣顆粒的凝血因子HA蛋白、神經氨酸酶NA蛋白和細胞基質M2蛋白的基因表達構架；

圖2為H5N1禽流感病毒樣顆粒的克隆載體pVD5質粒基因表達構架；

圖3為H5N1禽流感病毒樣顆粒的表達載體PTG3828質粒基因表達構架；

圖4為H5N1禽流感病毒樣顆粒的電子顯微鏡照片；