[發(fā)明專利]一種借助60Co-γ射線誘變和小孢子培養(yǎng)創(chuàng)制大白菜突變體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410025211.0
• 申請日: 2014-01-21
• 公開（公告）號: CN103782902A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮輝;黃勝楠;劉志勇;章云;姚潤鵬;李丹楊;李承彧;冀瑞琴;王玉剛
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H1/06
• 分類號: A01H1/06;A01H4/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 張述學(xué)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在小孢子培養(yǎng)過程中結(jié)合⁶⁰Co-γ射線誘變創(chuàng)制大白菜突變體的方法。

背景技術(shù)

大白菜屬于十字花科蕓薹屬A基因組植物，是我國種植面積最大的蔬菜作物。大白菜的基因組序列已經(jīng)于2011年釋放，其分子生物學(xué)研究進入了功能基因組階段，構(gòu)建大白菜突變體庫是研究其功能基因組學(xué)的重要基礎(chǔ)。

誘變產(chǎn)生突變體的方法包括物理誘變，化學(xué)誘變，T-DNA插入誘變和AC/DS?轉(zhuǎn)座誘變等。物理誘變是獲得突變體的常用方法，具有誘變作用強，誘發(fā)突變譜廣，突變頻率高，突變體易穩(wěn)定，微突變類型多而且有益變異相對較多等優(yōu)點。

傳統(tǒng)的誘變處理方法，主要是處理植株的種子，在田間對誘變植株進行鑒定和選擇。利用小孢子為誘變材料與誘變種子相比具有明顯的優(yōu)勢：一是以單個小孢子細胞為單元進行誘變處理，可以在很小的空間內(nèi)處理非常大的群體，可以大幅度提高誘變效率；二是在單倍體小孢子培養(yǎng)前進行誘變處理，一旦突變了的小孢子再生成雙單倍體植株，其突變基因是純合的,?突變性狀在當(dāng)代就能表現(xiàn)，而且后代不再分離。本發(fā)明將⁶⁰Co-γ射線輻射誘變處理與小孢子培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可以快速創(chuàng)制出純合的大白菜突變體，加快突變體庫的創(chuàng)建步伐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是創(chuàng)建一種快速創(chuàng)制大白菜突變體的新方法，將⁶⁰Co-γ射線處理和小孢子培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，快速獲得純合的大白菜突變體，大幅度提高突變體庫創(chuàng)建的效率。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案，主要過程如下：

（1）所用的誘變材料為小孢子DH系，在開花期，選取其長度為2-4?mm的未開放花蕾，小孢子發(fā)育期為單核晚期至二核早期，用⁶⁰Co-γ射線進行輻照處理，劑量為20～60Gy，劑量率為1.58?Gy/min；

（2）從照射后的花蕾中分離純化小孢子，進行液體淺層培養(yǎng)，獲得再生的小孢子植株M₀代；

（3）將M₀代植株移栽到溫室，用流式細胞儀鑒定其倍性，篩選出雙單倍體植株；

（4）在所獲得的雙單倍體植株中，通過鑒定葉色、葉形、株型、花瓣顏色、花瓣形態(tài)、花瓣大小和雄蕊育性植物學(xué)性狀，初步篩選出突變體植株；

（5）所有雙單倍體植株自交，其中雄性不育突變體與野生型雜交，收獲M₁種子；

（6）播種M₁種子，進一步鑒定突變性狀，獲得穩(wěn)定遺傳的突變體。

上述過程（2）的具體內(nèi)容：將照射后的花蕾分離小孢子進行培養(yǎng)。花蕾在超凈工作臺內(nèi)經(jīng)濃度為75％乙醇溶液表面消毒30s后，用濃度為0.1％HgCl₂溶液消毒8?min，再用無菌水沖洗3次，每次5?min。消毒后的花蕾放入滅過菌的小燒杯內(nèi)，加入蔗糖濃度為130g·L^-1，PH值為5.8的B5培養(yǎng)基，用無菌研棒碾壓花蕾，使小孢子游離出來，用40μm孔徑的尼龍網(wǎng)過濾含小孢子的懸浮液，收集濾液于10?mL離心管中，1000?rpm離心3?min，棄上清液，沉淀加5?mL?B5培養(yǎng)基，搖勻，1000?rpm離心3?min，棄上清液，重復(fù)2次，所得沉淀物即為純凈小孢子。將純化后的小孢子用NLN培養(yǎng)基稀釋，稀釋密度至1~2×10⁵個·mL^-1，以每皿5?mL小孢子懸浮液分裝入直徑60?mm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi),?每皿添加100μL高溫滅菌后的0.5g·L^-1瓊脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蠟?zāi)し饪??33℃恒溫箱中暗培養(yǎng)24小時,?再轉(zhuǎn)移至25℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)10～15天，肉眼可見胚狀體后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)數(shù)為40～60轉(zhuǎn)/分鐘搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃；將子葉期胚狀體轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上，在25℃，16h/8h光周期條件下培養(yǎng)；獲得小孢子再生植株后，再進一步將再生植株接種到MS培養(yǎng)基上進行人工誘導(dǎo)生根培養(yǎng)；