[發明專利]可與Hpa1結合并提高植物抗病性和衰老的植物基因HIR1

無效

• 申請號: 201410024877.4
• 申請日: 2014-01-20
• 公開（公告）號: CN103820466A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 陳功友;鄒麗芳;崔一平;馬文秀;李爭
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物技術領域的基因，尤其涉及一種可與Hpa1結合并提高植物抗病性的植物基因HIR1。

背景技術

植物病原菌能夠侵染寄主植物，在侵染點附近引起癥狀，是克服了寄主植物的免疫系統，成功地從寄主植株獲得了所需的營養物質。在病原菌與寄主植物的識別過程中，雙方的多種基因和信號傳導機制共同參與。植物病原細菌的III型分泌系統是病原菌能夠侵染和建立寄生關系的關鍵致病因子，它是由近30個基因形成的基因簇，經過一定的表達和調控機制組裝成一個hrppilus，將細菌合成的效應蛋白分泌到細胞外，注射到寄主植物細胞，引發寄主植物的抗病或感病反應。通過III型系統分泌并注射進入植物細胞的效應蛋白分為兩大類：一類是起到轉錄激活作用，通過特定的識別密碼，特異性地結合到寄主植物基因啟動子區域，激活下游基因的表達。另一類效應蛋白所起的功能是干擾前種識別。因此，植物病原細菌在植物上引發的是感病還是抗病癥狀，取決于侵染過程中分泌蛋白所誘導的植物反應是感病反應更強還是抗病反應更強。

Harpin蛋白是植物病原細菌的蛋白激發子，由植物病原細菌的III型分泌系統的1個基因編碼，超量的Harpin蛋白能夠在非寄主指示植物上誘導細胞快速死亡，引起過敏反應的產生。目前，已經從植物病原細菌中發現了至少5種Harpin蛋白，其中包括來自稻黃單胞菌的Hpa1蛋白。這些Harpin蛋白雖然都可以從III型系統分泌到胞外，但它們的氨酸序列不盡相同，揭示非寄主指示植物對它們的識別存在差異。由Harpin蛋白誘導的細胞快速死亡就是植物產生的一種抗病反應。從植物中篩選和克隆Harpin蛋白的互作或識別蛋白，一方面有助于解析Harpin蛋白誘導植物抗病反應的作用機理，另一方面，更能有助于我們發掘和利用來源于植物源的抗性基因。通過一定的分子設計，在植物中改進Harpin互作或識別蛋白的表達水平，可以有效的誘導植物抗病反應信號。該途徑最大的優點在于避開了病原菌侵染時，細菌效應分子在識別階段對抗病反應的干擾或抑制，而直接從下游啟動植物的抗病信號，不易被病原生物的遺傳進化所克服，導致抗性喪失。

發明內容

本發明的目的，在于克服現有抗病基因資源不足，大多易被病原菌遺傳進化克服的缺點，提供一種來自水稻和煙草植物的可與Hpa1結合并提高植物抗病性的植物基因HIR1。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

本發明涉及的是來自水稻和煙草植物的HIR1，能夠識別稻黃單胞菌激發子Hpa1，并增強植物的抗病性。通過蛋白質-蛋白質互作，以Hpa1為誘餌，從水稻中克隆了其互作基因OsHIR1，序列如SEQ?ID?NO.1所示，序列長度為2262bp，編碼754個氨基酸，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；從煙草中克隆了其互作基因NbHIR1，序列如SEQ?ID?NO.3所示，序列長度為1530bp，編碼510個氨基酸，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；OsHIR1和NbHIR1能夠結合Hpa1中的特異性序列為SEQ?ID?NO.5，能夠特異性被Hpa1結合的序列為SEQ?ID?NO.6。所述的HIR1基因產物HIR1蛋白能夠在病原菌侵染時增加合成，增強植物的抗病反應，加速煙草葉片侵染點附近細胞的快速衰老和死亡。

本發明的HIR1基因由以下方法獲得：

利用酵母雙雜交技術，以稻黃單胞菌蛋白激發子Hpa1為誘餌，從水稻cDNA文庫中篩選互作蛋白基因OsHIR1，與已經登錄的日本晴水稻數據庫比對，發現其與α-半乳糖基轉移酶編碼基因具有100％的一致性。根據序列的保守性，設計簡并引物從煙草中擴增出同源基因NbHIR1。將NbHIR1基因克隆到病毒載體2mDNA1上，利用病毒介導的基因沉默技術(VIGS)在非寄主植物煙草上瞬時表達，植株對Hpa1蛋白的敏感性降低，產生過敏反應的最低有效濃度增加了3倍，同時，生長優勢明顯，株高和葉片大小增加明顯。通過接種實驗，HIR1過表達植物的抗病能力最強。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明獲得了煙草和水稻植物中識別稻黃單胞菌Hpa1蛋白的HIR1的編碼序列，對植物的生長發育和抗病性具有重要作用，為運用分子遺傳學方法改良作物的生長和抗病性狀提供了抗性資源。所獲得的基因來源于植物本身，可以獲得穩定的抗性遺傳，克服了病原菌致病效應分子進化所導致的抗性喪失，具有廣泛的應用前景。